综合试验(三 Folin-酚法测定蛋白质含量

2010年 6月 3日

摘要:本实验包括两个步骤,第一个步骤为制作标准曲线,第二个步骤为制备 样品(牛奶和酪蛋白粗制品并用 Folin —酚法进行蛋白质含量的测定,得到酶 原液蛋白含量为 23 (ug/ml;洗脱峰Ⅰ蛋白含量 82.692(ug/ml;洗脱峰Ⅱ蛋 白含量 121.923(ug/ml; 洗脱峰Ⅲ蛋白含量 83.077(ug/ml。 此次实验与理论值 仍存着一定的偏差。通过本次实验的操作以及对实验结果的分析,了解 Folin — 酚法准确测定蛋白含量的原理方法,以及其相关的影响因素。

一、实验目的:

1、测定实验中原液和洗脱液中蛋白质的含量

2、掌握 Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法。

3、熟悉分光光度计的操作。

二、理论背景:

Folin-酚试剂法包括两步反应:第一步是在碱性条件下, 蛋白质与铜作用生 成蛋白质 -铜络合物; 第二步是此络合物将磷钼酸 -磷钨酸试剂 (Folin 试剂 还原, 产生深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物 ,颜色深浅与蛋白质含量成正比。此法操 作简便,灵敏度比双缩脲法高 100倍,定量范围为 5~100μg 蛋白质。 Folin 试 剂显色反应由酪氨酸、 色氨酸和半胱氨酸引起, 因此样品中若含有酚类、 柠檬酸 和巯基化合物均有干扰作用。 此外, 不同蛋白质因酪氨酸、 色氨酸含量不同而使 显色强度稍有不同。

三、实验装置:

1.实验材料

原液, 洗脱峰

2.仪器

(1移液管(0.5mL 、 1mL 、 5mL (2量筒

(3分光光度计 (4移液管、移液

3.试剂(纯度均为分析纯

(1 0. 5mol/L NaOH

(2 试剂甲:(A 称取 10g Na2CO 3, 2g NaOH和 0.25g 酒石酸钾钠,溶解后用 蒸馏水定容至 500mL 。 (B 称取 0.5g CuSO 4·5H 2O ,溶解后用蒸馏水定容至

100mL 。

每次使用前将(A 液 50份与(B 液 1份,即为试剂甲,其有效期为 1d ,过 期失效。

(3试剂乙:在 1.5L 容积的磨口回流器中加入 100g 钨酸钠(Na 2WO 4·2H 2O 和 700mL 蒸馏水,再加 50mL 85%磷酸和 100mL 浓盐酸充分混匀,接上回流冷 凝管,以小火回流 10h 。回流结束后,加入 150g 硫酸锂和 50mL 蒸馏水及数滴 液体溴,开口继续沸腾 15min ,驱除过量的溴,冷却后溶液呈黄色(倘若仍呈绿 色,再滴加数滴液体溴,继续沸腾 15min 。然后稀释至 1L ,过滤,滤液置于棕 色试剂瓶中保存,使用前大约加水 1倍,使最终浓度相当于 1mol/L。

(4标准牛血清白蛋白溶液:在分析天平上精确称取 0.0250g 结晶牛血清白蛋 白,倒入小烧杯内,用少量蒸馏水溶解后转入 100mL 容量瓶中,烧杯内的残液 用少量蒸馏水冲洗数次,冲洗液一并倒入容量瓶中,用蒸馏水定容至 100mL , 则配成 250μg/mL的牛血清白蛋白溶液。 (试剂已配好

四、实验步骤

1、标准曲线的制作

(1系列标准牛血清白蛋白溶液的配制:取 6支普通试管,按表 1加入标准浓 度的牛血清白蛋白溶液和蒸馏水, 配成一系列不同浓度的牛血清白蛋白溶液, 做 两组平行。然后各加试剂甲 5mL ,混合后在室温下放置 10min ,再各加 0.5试剂 乙,立即混合均匀(这一步速度要快,否则会使显色程度减弱 。 30min 后,以 不含蛋白质的 1号试管为对照, 用分光光度计于 650nm 波长下测定各试管中溶液 的光密度并记录结果。

表 1 牛血清白蛋白标准曲线制作

1 2 3 4 5 6

牛血清白

蛋白溶液

(mL 

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

蒸馏水

(mL 

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0

(2标准曲线的绘制:以牛血清白蛋白含量(μg/ml为横坐标,以光密度 平均值为纵坐标绘制标准曲线。

2、样品的制备及测定

从分离峰中各取 1ml 溶液,分别加入试剂甲 5ml , 混匀后放置 10min ,在各加试 剂乙 0.5 ml ,迅速混匀,室温放置 30min ,于 650nm 波长下测定光密度,并记录 数据。

五、注意事项 :

进行测定时, 加 Folin 试剂要特别小心, 因为 Folin 试剂仅在酸性 pH 条件下 稳定, 但此实验的反应只是在 pH10的情况下发生, 所以当加试剂乙 (Folin 试剂 时,必须立即混匀,以便在磷钼酸 -磷钨酸试剂被破坏之前即能发生还原反应, 否则会使显色程度减弱。

六、实验结果:

表 1-1 标准牛血清白蛋白标准曲线数据处理

1 2 3 4 5 6 牛血清白蛋白溶液(mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水(mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 牛血清白蛋白含量 (ug/ml 0 50 100 150 200 250 A650nm 0.000 0.133 0.275 0.383 0.511 0.8

(2样品测试结果

计算:

蛋白含量根据标准曲线得出方程 y=0.0026X 计算,

蛋白质含量按下式计算:X(ug=A*稀释倍数 /K

蛋白含量(ug/ml =X(ug /体积(ml 

A------测得的光密度

K------标准曲线斜率

因此 :

淀粉酶液蛋白含量 0.116*200/(1*0.0026 =23(ug/ml

洗脱峰Ⅰ蛋白含量 0.215*1/(1*0.0026 =82.692 (ug/ml

洗脱峰Ⅱ蛋白含量 0.317*1/(1*0.0026 =121.923(ug/ml

洗脱峰Ⅲ蛋白含量 0.216*1/(1*0.0026 =83.077 (ug/ml

七、讨论

1、此次实验步骤较为简单,能较好的掌握 Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和 方法; 更加熟悉分光光度计的使用, 并且测定出蛋白质含量。 总体实验较为成功。

2、误差分析

实验结果有一定的偏差,可能原因如下:

（1）样品所含各种氨基酸的比例与标准有所不同，而不同氨基酸比例不同对实 验结果有影响，有的较大有的较小； （2）加入乙液应立即不断振荡，每次实验振荡程度对显色结果有影响，而且时 间不及时时造成的误差更大； （3）所使用分光光度计的数值不稳，也会造成一定误差。尤其是酪蛋白的实验 中用已经比色的比色皿在其他仪器上误差加大，因为没有对照实验溶液，只好实 验，误差加大了； （4） 比色皿不够清洁， 30min 时间未到就拿去分光光度计测也造成了一定误差。 思考题解答 1、查阅课本、参考书，试述有几种测定蛋白含量的方法，及其简要原理和优、 缺点。 测定方法 原理 灵敏度 干扰物质 优点 缺点 凯 氏 定 氮 蛋白质中的氮通过硝化 灵敏度低， 非蛋白氮 法 全部转变成无机氮， 再通 适用于 （Kjedahl 过分析化学的手段测出 0.2~ 1.0mg 法） 氮的含量， 根据氮在蛋白 氮， 误差为 质分子中的平均含量 2％ 16％， 即可求得样品中蛋 白质含量 双缩脲法 具有两个或两个以上肽 灵敏度低 硫酸铵； Tris 缓冲 液； 某些氨基 酸 各种嘌吟 和嘧啶； 各种核苷 酸 （可用三 氯乙酸沉 淀蛋白质 而分离） 硝 化 样 品 耗时 繁琐 不 需 可 溶 装置需大量样 对所有蛋 品 白 质 的 测 不是检测蛋白 量 都 是 一 质而是检测氮 致的 简便 迅速 缺乏专一性 灵敏度较差 （ Biuret 键的化合物皆有双缩脲 1～20mg 法） 反应， 因此蛋白质在碱性 溶液中也能与 Cu2+形成 紫红色化合物， 颜色深浅 与蛋白浓度成正比 紫 外 分 光 蛋白质分子中酪氨酸色 较为灵敏 光度法 氨酸在 280nm 左右具有 50～100g 最大吸收， 由于在各种蛋 白质中这几种氨基酸含 量差别不大， 所以蛋白质 在 280nm 的吸收值与浓 度具正相关 不 受 蛋 白 所需样品量在 质 特 异 性 （ 0.2 － 1.7 ） 的影响 mg/ml 方法简便 测定迅速 收 无干扰 若样品蛋白中 酪氨酸含量与 比较差别较大 误差， 其他具有 紫外吸收的物 质有干扰 样 品 可 回 标准蛋白质相 低 浓 度 盐 时， 测定有一定 

考 马 斯 亮 考马斯亮蓝 G-250 在酸 灵敏度最 蓝 G 2 5 0 性溶液中为棕红色当它 高 染 色 法 与蛋白质通过范德华键 1～5g (Bradford 结合后变为蓝色且在蛋 法 白质一定浓度范围内符 合比尔定律可在 595nm 处比色测定 Folin- 酚 蛋白质与铜在碱性条件 灵敏度高 试剂法 下生成铜络合物， 将磷钼 5～100g 酸-磷钨酸试剂还原，产 生的颜色深浅与蛋白质 含量成正比 预习时疑问解答 强碱性缓 冲液； TritonX-1 00; SDS 操 作 简 便 不同蛋白质之 迅 速 消 耗 间差异大且标 样品量少 准曲线线性差 酚类、 柠檬 反应灵敏， 花费时间较长， 酸 、 巯 操作简单， 干扰因素多， 不 （qiu）基 显 色 作 用 稳定， 反应只在 化合物 较好 极短时间内有 效 （1）为什么加入甲试剂混合后要在室温下放置 10min? 答：反应完全充分，已经优化的时间。 （2）为什么加入已试剂混合均匀后要 30min 后才进行波长测定? 答：反应完全充分，已经优化的时间。 八、结论： 此次试验较为简单，利用蛋白质与铜在碱性条件下生成蛋白质-铜络合物，将 磷钼酸-磷钨酸试剂，即 Folin 试剂还原，产生的颜色深浅与蛋白质含量成正比 的原理进行实验。我们得出的实验结果为酶原液、洗脱峰Ⅰ、洗脱峰Ⅱ、洗脱峰 Ⅲ的蛋白含量分别为 23(ug/ml 、82.692(ug/ml、121.923(ug/ml、83.077 (ug/ml 。通过此次实验，学会了用 Folin-酚法测定酶原液及洗脱峰中蛋白质 含量的方法步骤，更加了解其原理。此外，通过对不同测定蛋白质含量的方法的 归纳与比较， 让我更深入地了解了不同方法的优缺点，对以后的实验提供了很好 的参考知识。 参考文献： [1] 倪莉，张雯，饶平凡编写的《生物化学实验指导书》2010 年。 [2] 张洪渊主编.生物化学教程(第三版.四川大学出版社 下载本文