摘要：采用细胞培养法对疑似犬细小病毒的粪便和内脏进行了分离和鉴定，并对分离到的病毒进行生物学特性鉴定和动物回归试验。结果共分离到3株CPV，分离株在猫肾细胞F81产生明显细胞病变，血凝效价达1∶27～1∶210，细胞病变能被犬细小病毒阳性血清所抑制，接种幼犬后，分离株3可以引起试验犬发病死亡。

关键词：犬细小病毒；分离；鉴定

犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）属于细小病毒科细小病毒属，为单股、负义、线形无囊膜的DNA病毒[1]。CPV可引起犬的出血性肠胃炎和心肌炎，并使白细胞大量减少，在幼犬中的发病率和死亡率都很高[2]。CPV对多种理化因素和常用消毒剂具有较强的抵抗力，在4～10 ℃存活6个月，37 ℃存活2周，56 ℃存活24 h，80 ℃存活15 min，在粪便中可存活数月至数年[3]；该病毒对乙醚，氯仿和醇类有抵抗力[4]。CPV一年四季均可发病，以冬、春多发[5]，饲养管理条件骤变、长途运输、寒冷、拥挤均可促使该病发生[6]。病犬是主要传染源，其呕吐物、唾液、粪便中均有大量病毒[7]。根据临床症状和血清学反应，可做出准确诊断[8-13]。本研究通过对山东毒株分离，并对其部分生物学特性进行研究，为该病的防治和后续研究提供一定的理论基础。

1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  主要试剂  DMEM培养基为Gibco产品；小牛血清、谷氨酸胺、双抗、胰蛋白酶等购自大连宝生物TaKaRa有限公司；其他化学试剂均为分析纯试剂。

　　1.1.2  病料  病料为2009～2011年聊城大学兽医院收集或其他养犬场送检的可疑CPV病料，包括20份粪便样品和10份脏器。

　　1.1.3  试验动物和细胞  8只40～50日龄的山东细犬幼犬（抗CPV HI抗体效价小于1∶4），健康状况良好；猫肾传代细胞系（F81）和犬肾传代细胞系（MDCK）等由聊城大学农学院实验室保存。

1.2  方法

　　1.2.1  试剂的配制

　　1）1%猪红细胞悬液的制备。用20 mL注射器内吸入阿氏液3～5 mL，于健康猪前腔静脉采血10～15 mL，立即混匀，4 ℃保存备用。使用时用PBS洗涤保存的猪红细胞，1 000 r/min离心5 min，洗涤3次，取红细胞泥1 mL加稀释液100 mL，再加入小牛血清白蛋白0.1 g，即为1%猪红细胞悬液。

　　2）HA抗原配制。用移液器向V型血凝板每孔加稀释液25 μL，然后吸取25 μL经灭活的CPV细胞培养物，在血凝板上倍比稀释，最后1孔不稀释，作为阴性对照；接着每孔加稀释液25 μL和1%猪红细胞悬液50 μL，于振荡器上振荡1 min混匀，于4 ℃冰箱静置1～2 h，待红细胞完全沉淀后判定。判定的方法是以50%红细胞凝集为终点，在对照孔红细胞完全不凝集，呈圆形小点沉于孔底时，凝集终点的稀释倍数即为该抗原的HA效价，将此效价除以8，即是8单位血凝抗原的稀释倍数。

　　1.2.2  病料的处理

　　1）粪便样品的处理：将病犬粪便用DMEM培养液稀释（m∶m=1∶9），再加等量的氯仿混匀，4 000       r/min离心10 min，取上清，加入双抗200 μL，4 ℃过夜，再经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，-20 ℃保存备用。

　　2）脏器样品的处理。将脏器样品用灭菌后的研磨器进行研磨，并反复冻融3次，同时加入9倍体积的DMEM细胞培养液，5 000 r/min离心25 min，取上清液，经过滤除菌。将处理好的样品置-20 ℃保存，待分离鉴定。

　　1.2.3  血清样品HI抗体效价的测定  取待检血清0.2 mL，加入猪红细胞悬液1滴，混匀于室温吸收1 h，离心取上清液待检。先用移液器向血凝板每孔加稀释液25 μL，然后吸取待检血清25 μL，在血凝板上倍比稀释，最后2孔不稀释作为对照，每孔加8单位HA抗原25 μL，最后1孔不加，作为血清对照。加完后振荡混匀，于4 ℃冰箱静置1～2 h判定。判定的方法是以完全不凝集为终点，在抗原对照孔完全凝集，血清对照孔完全不凝集的情况下，血清出现终点抑制的稀释倍数，即为该血清的HI效价。

　　1.2.4  病毒的分离  采用同步接毒法，在F81细胞消化传代后，按培养液量体积的1/10接入处理过的样品，37 ℃静置培养3～5 d，每天观察有无细胞病变。如无细胞病变，则于培养的第4～5 d收取上清，继续按常规传代培养，至第5代仍无病变判为分离结果阴性；若出现细胞病变则分离结果为阳性，反复冻融3次，收毒，-20 ℃保存。

　　1.2.5  生物学特性鉴定

　　1）理化特性。按《动物病毒学》[3]规定进行，取分离病毒的F81细胞培养物，分别做以下处理：50 ℃水浴作用60 min；加20%乙醚振荡10 min，放4 ℃过夜，并无菌挥发除去全部乙醚；将病毒液调节pH为3时于4 ℃作用处理1 h，再用0.1 mol/L NaOH调至pH 7.2，进行耐酸性试验，然后分别用F81细胞测定其TCID50变化。

　　2）红细胞血凝试验。采用微量血凝（HA）试验，分别用0.5%的鸡、猪、大鼠、兔和人（O型）的红细胞悬液测定病毒培养液的HA效价。

　　3）细胞敏感谱。选用猫肾传代细胞系（F81）、犬肾传代细胞系（MDCK）作为接种对象，分别分离得到HA效价≥1∶128的细胞培养液。按常规方法进行同步接毒，37 ℃静置培养24 h后，换液，每天观察细胞病变（CPE），4～5 d收获冻融，再以同样方法连传5代，以出现CPE作为感染指标。

　　1.2.6  动物回归试验

　　用所分离的CPV分离株1，2和3（HA效价均为1∶512～1∶2 048）对试验犬进行人工感染试验。接种途径为口服，剂量为5 mL，设空白对照组和试验组。将幼犬随机分为4组，每组2只。试验Ⅰ组幼犬接种分离株1；试验Ⅱ组幼犬接种分离株2；试验Ⅲ组幼犬接种分离株3；将第4组设为空白对照，接种生理盐水。对4组试验犬进行隔离饲养。接种后，每天观察试验犬的临床变化并进行体温的测量，每3 d进行一次白细胞计数，自接种后5 d开始收集粪便，并进行CPV的HA/HI检测。攻毒后观察15 d，如无眼观临床症状、白细胞总数正常，则视为试验犬健康。2  结果与分析

　　2.1  病毒分离结果

　　将处理后的病料接种F81细胞后，采用同步接毒进行病毒分离。在第一代细胞病变不明显，但盲传至第3～5代时，部分接毒细胞出现细胞圆缩、拉网和脱落等细胞病变，而对照细胞排列紧密，生长旺盛，呈不规则形（见图1～2）。试验共从3份病料中分离出病毒，分别命名为CPV分离株1、分离株2和分离株3。

　　2.2  生物学特性

　　1）理化特性。经50 ℃、20%乙醚和酸（pH 3.0）处理后，通过比较处理前后TCID50的变化发现TCID50效价相差都小于2个数量级，变化不大。说明分离毒株能抵抗乙醚、酸（pH 3.0）和热（50 ℃），这与细小病毒理化特性一致。

　　2）红细胞血凝结果。采用微量血凝试验测定各病毒分离株对鸡、猪、大鼠、兔和人红细胞的HA效价。分离株对猪红细胞的凝集效价达到1∶27～1∶210；而对其他红细胞的血凝效价为20，没有血凝性。与文献记载的CPV血凝谱相符。

　　3）细胞感染谱。将CPV分离株在多种细胞上同步接毒培养5代，并每天观察CPE。结果表明，有3株CPV分离株连续传代后出现细胞病变现象，分别命名为分离株1、2、3。

　　2.3  动物回归试验结果

　　用病毒分离株感染幼犬后第5～6天，试验组均发病。其中试验Ⅲ组即接种CPV分离株3的2只幼犬在接种后第5天开始出现临床症状，精神沉郁，呕吐，排稀粪。随后转为拉血、脱水、食欲废绝，最后死亡。

　　对病死幼犬病理剖检发现空肠和回肠局部充血、粘膜脱落，肠系膜淋巴结肿胀，肠腔内有血样粪便。其他2组试验组犬接种后第6天表现出精神沉郁，体温增高，食欲下降，拉稀便，但后来自行康复。所有接毒试验犬的白细胞总数均出现不同程度的下降。但对照犬的白细胞总数没有明显变化。

　　试验组犬在攻毒后5～8 d，幼犬粪便的HA效价为1∶128～1∶512，对照犬的粪便HA检测结果均为阴性。

　　3  讨论

　　3.1  病毒分离

　　本试验通过采集疑似CPV感染犬的粪便和内脏，经处理后接种于猫肾细胞分离病毒，然后通过对分离病毒的生物学特性、血凝抑制试验和动物回归试验等方法对病毒株进行了鉴定。

　　CPV无囊膜，用氯仿处理粪便可使有囊膜的病毒失活，有利于该病毒的分离和纯化。部分出血很明显的细小病毒样本，反而没有分离出病毒。可能因为在疾病中后期，由于肠道出血，血液中的犬细小病毒抗体和细小病毒形成抗原抗体复合物，造成样品中的病毒量减少，细胞分离呈阴性。粪便中毒素和组织分解代谢产物会对培养细胞产生一定的影响。因此，如何处理粪便，尽量减少对细胞的毒性，成为能否成功分离病毒的关键。可以减少接种样本数量（1/20～1/30），或接种后及时换液，可有效降低粪便中毒素对细胞的毒害作用，提高病毒分离率。CPV的复制须完全依赖宿主细胞DNA的复制机制，复制主要发生在细胞周期的S期晚期和G2早期，病毒的接种最好采用同步接种方式。所以，在试验中采用了同步接毒的办法。但由于样本的毒性，可以在传代后6～8 h再接种，能减少样本对细胞的影响。

　　3.2  病毒鉴定

　　通过对分离的病毒进行理化鉴定，发现所分离的病毒具有抗酸、抗脂溶剂和耐热的特性，与文献报道的细小病毒的理化性质一致。通过对不同动物红细胞的血凝谱测定，所分离病毒能够凝集猪的红细胞，不能凝集鸡、兔和人的红细胞，与报道的CPV的血凝谱一致。病毒除了能在F81细胞增殖外，病毒株2还可以在MDCK细胞增殖。病毒血凝抑制试验进一步确认所分离的病毒血凝特性能够被犬特异性细小病毒血清抑制，证明试验中分离到的病毒为犬细小病毒。

　　3.3  动物回归试验

　　为了检验所分离犬细小病毒的致病性，进行了动物回归试验，分别将3株病毒人工接种试验犬。动物试验结果显示，试验组均发病，表现为拉稀、脱水、精神沉郁、食欲废绝，对照组健康。

　　本试验采用F81细胞同步接毒的方式从送检的疑似CPV感染的30份样品中分离出3份CPV阳性样品。并对分离病毒进行了生物学和动物接种试验，检验了分离病毒的致病性。其中分离株3可以引起接种幼犬死亡，表明是一株犬细小病毒的强毒株。本研究为犬细小病毒病的预防和控制提供了理论依据，同时为深入研究该病毒的致病机理奠定了基础。

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