一、本课程的性质和任务

    微生物学实验是生物学重要的基础课之一，特别是随着分子生物学的发展与拓宽，微生物学方法与技术显得尤为重要。此外，医学、农学、林学等学科，甚至地质学、太空学等也需微生物的方法与技术。因此，熟悉掌握微生物学方法与技术，对其它很多学科的发展有直接的影响。无菌操作技能和无菌概念的建立是微生物学实验中最重要的内容，由于微生物学实验结果的观察有的需几天后再观察，这样学生需常到实验室来，花费时间较多。 

本课程的任务：

1. 微生物学实验主要任务是使学生掌握研究与应用微生物的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术，使学生具有适应于从事相关学科的基础理论研究与实际生产应用的微生物学实验技能。

2.     与微生物学基础理论课紧密结合，使学生将理性知识与感性认识有机地结合，将书本知识用于实验，在实验中更深地理解基础理论，提高学生的综合能力与创新意识。

3.     提高学生分析问题和解决问题的能力。根据本学科的特点，逐步使学生认识微生物的基本特性，比较它们与其它生物的相似和不同之处，知道如何研究微生物以及对研究中所出现的问题点样分析，并加以解决。

二、教学要求与教学方法

1. 教学要求

1)  注重微生物学基础实验技能的掌握与提高，克服盲目追求新颖而忽视基础的倾向；

2)     实验课前要预习，明确每次实验的目的与基本步骤；

3)     在实验中要有严紧的科学态度，尊重事实与实验结果，要善于发现新现象；

4)     树立密切合作的风气，包括学生与老师、班与班、组与组、组长与组员之间的密配合。

2. 教学方法

1)     以学生自己动手为主，老师在适当时间予以提示；

2)     对实验中所出现的一些现象多向学生提出问题，使它们学会分析结果，并与理论知识有机结合；

3)     根据实验的进行程度，引导学生更深入思考，逐步树立他们的创新意思；

4)     严格要求使操作技能规范化，老师作示范，强调其要点学生自己练。

三. 教学学时分配与安排

      本课程讲授按每周4学时安排， 全学期共16周。

实验一 ： 1.本学期教学计划安排及要求；2.环境微生物的检测；3.灭菌器皿的准备 

实验二  ：  1. 微生物菌落形态的观察；2. 细菌简单染色及个体形态的观察 

实验三： 1. 酸奶的制作；  2. 革兰氏染色 (革兰氏阳性菌、阴性菌)        

实验四：培养基的配制          

实验五：神农架自然保护区土壤样品中微生物的分离与纯化      

实验六：  1.放线菌的形态结构（试管法）；2.霉菌形态结构的观察(压片法等)     

实验七：  1.酵母菌死活染色及形态观察；2.细菌的鞭毛染色与运动性观察     

实验八：  1.平板计数法；2.光电计数法；3.直接计数法(显微镜)         

实验九： 1. 大分子物质的水解试验；2. 糖发酵试验；3. IMViC试验     

实验十：  1. 化学因素；2. 生物因素；3. 物理因素     

实验十一-----十二：1. 东湖水体中微生物的检测；2. 纯净水中微生物的检测；3. 自来水中微生物的检

                      测；4. 酸奶中细菌的检查

实验十三：DNA转化(固体转化法)     

实验十四： Ames试验      

实验十五：1. 实验问题解答；2. 本学期教学总结       

实验十六：期末考试

四．教学内容和要求

实验一  

[目的要求]

1. 证明实验室环境与体表存在微生物。

2. 比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型。

3. 观察不同类群微生物的菌落形态特征。

4. 体会无菌操作的重要性。

[实验原理]

平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在合宜温度下培养，1-2天内每一菌体即能通过很多次细胞而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。

[教学内容]  

实验室环境和人体表面微生物的检查

                        实验二 

[目的要求]    

1.明确培养基的配制原理。

    2.通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。

[实验原理]

    牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基，由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏，蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。

[教学内容]

牛肉膏蛋白胨培养基的制备

                       实验三  

 [目的要求]

    通过对高氏Ⅰ号培养基的配制、掌握配制合成培养基的一般方法。

[实验原理]

    高氏Ⅰ号培养基是用来培养和观察放线菌形态特征的合成培养基。如果加入适量的抗菌药物(如各种抗生素、酚等)，则可用来分离各种放线菌。此合成培养基的主要特点是含有多种化学成分已知的无机盐，这些无机盐可能相互作用而产生沉淀。此外，合成培养基有的还要补加微量元素。

[教学内容]

    高氏Ⅰ号培养基的制备

实验四  

 [目的要求] 

通过对分离真菌的马丁氏(Martin)培养基配制、掌握选择培养基的配制方法，并确选择的原理。

[实验原理]

马丁氏培养基是一种用来分离真菌的选择性培养基。这种培养基的特点是培养基中加入的孟加拉红和链霉素能有效的抑制细菌和放线功菌的生长，而对真菌无抑制作用，因而真菌在这种培养基上可以得到优势生长，从而达到分离真菌的目的。

[教学内容]

     马丁氏培养基的制备

实验五  

[目的要求]

1.了解干热灭菌的原理和应用范围。

2.学习干热灭菌的操作技术。

[实验原理]

干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固缓慢。

[教学内容] 

干热灭菌 

实验六 

[目的要求]

1.了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围。

2.学习高压蒸汽灭菌的操作方法。

[实验原理]

高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

[教学内容]

高压蒸汽灭菌

实验七  

[目的要求]

了解紫外线灭菌的原理和方法

[实验原理]

紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200-300nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机制主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成［O］，再使O2氧化生成自臭氧(O3)或使水(H2O)氧化生成过氧化氢(H2O2)。O3和H2O2均有杀菌作用。

[教学内容]

紫外线灭菌

实验八 

[目的要求]

了解过滤除菌的原理；掌握微孔滤膜过滤除菌的方法。

[实验原理]

过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。根据不同的需要选用不同的滤器和滤板材料。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分，但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。

[教学内容]

微孔滤膜过滤除菌

实验九  

[目的要求]

掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。

[实验原理]

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的方法有：1).简易单细胞挑取法; 2).平板分离法。 

土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。

[教学内容]

微生物的分离与纯化

实验十  

[目的要求]

1.了解不同的微生物在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征。

2.进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术。

[实验原理]

微生物的培养特征是指微生物在固体培养基上、半固体和液体培养基中生长后所表现出的群体形态特征。不同的微生物有其固有的培养特征，这些特征一般用固体、半固体和液体培养基来进行检测。 

检测微生物的培养特征时，接种和培养过程中必须保证不被其他微生物所污染，因此，除工作环境要求尽可能地避免或减少杂菌污染外，熟练地掌握各种无菌操作接种技术是很重要。

[教学内容]

微生物的培养特征

                          实验十一 

 [目的要求]

1.学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法。

2.初步认识细菌的形态特征。

3.巩固显微镜(油镜)的使用方法和无菌操作技术。

[实验原理]

简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷(酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷)，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着。染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。

当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。

[教学内容]

细菌的简单染色法

实验十二 

[目的要求]

1.  学习并初步掌握革兰氏染色法。

2.  了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。

[实验原理]

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，而后一些学者在此础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。

[教学内容]

革兰氏染色法

                         实验十三 

[目的要求]

1.  学习并初步掌握鞭毛染色法，观察细菌鞭毛的形态特征。

2.  学习用压滴法和悬滴法观察细菌的运动性。

[实验原理]

鞭毛是细菌的运动“器官”，细菌是否具有鞭毛，以及鞭毛着生的位置和数目是细菌的一项重要形态特征。细菌的鞭毛很纤细，其直径通常为0.01～0.02微米，所以，除了很少数能形成鞭毛束(由许多根鞭毛构成)的细菌可以用相差显微镜直接观察到鞭毛束的存在外，一般细菌的鞭毛均不能用光学显微镜直接观察到，而只能用电子显微镜观察。要用普通光学显微镜观察细菌的鞭毛，必须用鞭毛染色法。

[教学内容]

    鞭毛染色法及细菌运动性的观察

实验十四 

[目的要求]

1．  学习并掌握观察放线菌形态的基本方法。

2．  初步了线菌的形态特征。

[实验原理]

放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝(简称“基丝”)，基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝(简称“气丝”)，并进一步分化产生孢子丝及孢子。为了观察放线菌的形态特征，人们设计了各种培养和观察方法，这些方法的主要目的是为了尽可能保持放线菌自然生长状态下的形态特征。本实验介绍其中几种常用方法。

[教学内容]

放线菌形态的观察

实验十五 

[目的要求]

学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。增强微生物细胞大小的感性认识。

[实验原理]

微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小

的测定在显微镜下，借助于特殊的测量工具—测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。

[教学内容]

  微生物大小的测定

实验十五  

[目的要求]

1.  观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。

2.  掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。

[实验原理]

酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。

美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。

[教学内容]

酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别

                         实验十六 

[目的要求]

学习并掌握观察霉菌形态的基本方法；了解四类常见霉菌的基本形态特征。

[实验原理]

霉菌可产生复什分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体(尤其是繁殖菌丝)及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多(约为3～10微米)，常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。

[教学内容]

霉菌的形态观察

实验十七 

  [目的要求]

1.明确血球计数板计数的原理

2.掌握使用血球计数板进行微生物计数的方法。

[实验原理]

显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。

[教学内容]

显微镜直接计数法

                      实验十八  

[目的要求]

学习平板菌落计数的基本原理和方法。

[实验原理]

平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(colony -forming units, cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。

[教学内容]

平板菌落计数法

实验十九  

[目的要求]

1.了解光电比浊计数法的原理

2.学习、掌握光电比浊计数法的操作方法。

[实验原理]

当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池精确测出(图Ⅷ-4)。因此，可用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度--菌数标准曲线。因此，对于不同微生物的菌悬液进行光电比浊计数应采用相同的菌株和培养条件制作标准曲线。

[教学内容]

光电比浊计数法

实验二十  

[目的要求]

1.证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。

2.掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。

[实验原理]

微生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大的物质为较小的化合物，使其能被运输至细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖；脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等。

 [教学内容]

大分子物质的水解试验

实验二十一 

[目的要求]

1.了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用。

2.掌握通过糖发酵解释的方法。

[实验原理]

糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异。有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和气体(如氢气、甲烷、二氧化碳等)；有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。

[教学内容]

糖发酵试验

实验二十二 

[目的要求]

了解IMViC与硫化氢反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方法。

[实验原理]

IMViC是吲哚(Indol test)、甲基红(Methyl red test)、伏-普(Voges-Prokauer test)和柠酸盐(Citrate test)四个试验的缩写，i是在英文中为了发音方便而加上去的。这四个试验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，多用于水的细菌学检查。大肠杆菌虽非致病菌，但在饮用水中若超过一定数量，则表示受粪便污染。产气肠杆菌也广泛存在于自然界中，因此检查水时要将两者分开。

[教学内容]

IMViC试验

实验二十三

[目的要求]

    1. 了解微生物自动鉴定系统的原理及其优点

2. 学习与掌握Biolog自动鉴定的方法

 [实验原理]

要鉴定一种微生物，用传统的方法需进行大量的工作，其中微生物的生理生化反应是重要的内容之一，但所需时间很长。几十所来，根据微生物的主要生理生化特性相应建立了许多自动鉴定卡或板。迄今，借助计算机的快速发展又创建了不少的微生物自动鉴定系统，包括自动鉴定板（卡）、和数据库两大部份，这样能很方便地将鉴定卡插入计算机，判别实验结果，并将其结果与数据库中所收集的微生物信息进行比较，很快便确定待测菌株的分类地位

[教学内容]

Biolog微生物自动鉴定系统

                         实验二十四 

[目的要求]

1.了解常用化学消毒剂对微生物的作用。

2.学习测定石炭酸系数的方法。

[实验原理]

常用化学消毒剂主要有重金属及其盐类、酚、醇、醛等有机溶剂、卤族元素及其化合物、染料和表面活性剂等。重金属离子可与菌体蛋白质结合而使之变性或与某些酶蛋白的巯基相结合而使酶失活；有机溶剂可使蛋白质及核酸变性，也可破坏细胞膜透性使内含物外溢；碘可与蛋白质酪氨酸残基不可逆结合而使蛋白质失活，氯气与水发生反应产生的强氧化剂也具有杀菌作用；染料在低浓度条件下可抑制细菌生长。

[教学内容]

化学因素对微生物的影响

实验二十五 

[目的要求]

了解某一抗生素的抗菌范围，学习抗菌谱试验的基本方法。

[实验原理]

生物之间的关系从总体上可分为互生、共生、寄生、拮抗等，微生物之间的拮抗现象是普遍存在于自然界的，许多微生物在其生命活动过程中能产生某种特殊代谢产物如抗生素，具有选择性地抑制或杀死其它微生物的作用，不同抗生素的抗菌谱是不同的，某些抗生素只对少数细菌有抗菌作用。

[教学内容]

生物因素对微生物的影响

实验二十六 

[目的要求]

1.了解细菌接合导致传遗重组的基本原理。

2.学习细菌接合实验的基本方法。

[实验原理]

细菌接合是指供体菌与受体菌的完整细胞在直接接触时供体菌的DNA向受体菌单向传递而导致基因重组的现象。大肠杆菌的接合配对是由致育因子(F因子)的存在所决定的。

本实验采用的供体菌是大肠杆菌野生型Hfr菌株，对链霉素呈敏感性(Strs)，受体菌为大肠杆菌营养缺陷型突变体(Thr- Leu- Thi-)，需要苏氨酸，亮氨酸和硫胺素，对链霉素呈抗性(Strr)。短期接合配对以后，在含有链霉素和硫胺素的基本培养基上只能分离到苏氨酸和亮氨酸的重组子(Thr+ Leu+Thi-)，硫胺素标记位于转移染色体的末端，在短期配对过程中因配对中断难以转移到受体细胞，因此硫胺素是Thr+ Leu+Thi-重组子的必须生长因子。

[教学内容]

细菌的接合作用

实验二十七 

[目的要求]

学习噬菌体效价测定的基本方法。

[实验原理]

噬菌体的效价就是一毫升培养液中所含活噬菌体的数量。效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见的噬菌斑，因此，能进行噬菌体的计数。但因噬菌斑计数方法其实际效率难以接近100%(一般偏低，因为有少数活噬菌体可能未引起感染)，所以为了准确地表达病毒悬液的浓度(效价或滴度)一般不用病毒粒子的绝对数量而是用噬菌斑形成单位(Plague-forming units,简写成pfu)表示。

[教学内容]

噬菌体效价的测定

实验二十八  

 [目的要求]

学习并掌握生长谱法测定微生物营养需要的基本原理和方法。

[实验原理]

微生物的生长繁殖需要适宜的营养环境，碳源、氮源、无机盐、微量元素、生长因子等都是微生物生长所必需，缺少其中一种，微生物便不能正常生长、繁殖。在实验室条件下，人们常用人工配制的培养基来培养微生物。由于不同类型微生物利用不同营养物质的能力不同，它们在点植有不同营养物质的平板上的生长图形就会有差别，具有不同的生长谱，故称此法为生长谱法。该法可以定性、 定量地测定微生物对各种营养物质的需求，在微生物育种、营养缺陷型鉴定以及饮食制品质量检测等诸多方面具有重要用途。

[教学内容]

生长谱法测定微生物的营养要求

实验二十九 

 [目的要求]

1.学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。

2.了解水源水的平板菌落计数的原则.

[实验原理]

本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。

[教学内容]

水体中细菌总数的测定

实验三十 

 [目的要求]

1.了解牛乳的细菌学检查方法和质量判断标准。

2.学习牛乳的巴斯德消毒法

[实验原理]

从健康母牛体内刚挤出的牛奶，含有少量的正常起始微生物。但将牛奶装入未消毒的器具和在分装、运输过程中，会被很多其他微生物甚至致病菌污染。而且牛乳含有丰富的营养物质 (碳水化合物、蛋白质、脂肪、无机盐和维生素等)，在其中的微生物会很快繁殖，因此，一 份牛乳样品的细菌含量可反映母牛的健康状况和牛乳生产与保藏的条件。

[教学内容]

牛乳中细菌的检查下载本文