茚三酮显色法 氨基酸是组成蛋白质的基本单位也是蛋白质的分解产物。植物根系吸收、同化的氮素主要以氨基酸和酰胺的形式进行运输。所以测定植物组织中不同时期、不同部位游离氨基酸的含量对于研究根系生理、氮素代谢有一定意义。 一、原理 氨基酸与茚三酮共热时能定量地生成二酮茚胺。该产物显示蓝紫色称为 Ruhemans 紫。其吸收峰在 570 nm 而且在一定范围内吸光度与氨基酸浓度成正比。氨基酸与茚三酮的反应分两步进行第一步氨基酸被氧化形成 CO 2 、 NH 3 和醛茚三酮被还原成还原型茚三酮第二步所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和一分子氨脱水缩合生成二酮茚–二酮茚胺 Ruhemans 紫反应式如下 在一定范围内反应体系颜色的深浅与游离氨基的含量成正比因此可用分光光度法测定其含量。 二、实验材料、试剂与仪器设备 一实验材料 各种植物组织。 二试剂 1. 水合茚三酮试剂称取 0.6 g 再结晶的茚三酮置烧杯中加入 15 mL 正丙醇搅拌使其溶解。再加入 30 mL 正丁醇及 60 mL 乙二醇最后加入 9 mL pH5.4 的乙酸–乙酸钠缓冲液混匀贮于棕色瓶置 4 ℃下保存备用 10 d 内有效。 2. 乙酸–乙酸钠缓冲液 pH 5.4 称取乙酸钠 54.4 g 加入 100 mL 无氨蒸馏水在电炉上加热至沸使体积蒸发至 60 mL 左右。冷却后转入 100 mL 容量瓶中加 30 mL 冰醋酸再用无氨蒸馏水稀释至 100 mL 。 3. 标准氨基酸称取 80 ℃下烘干的亮氨酸 46.8 mg 溶于少量 10 异丙醇中用 10 异丙醇定容至 100 mL 。取该溶液 5 mL 用蒸馏水稀释至 50 mL 即为含氨基氮 5 μ g/mL 的标准氨基酸溶液。 4. 0.1 抗坏血酸称取 50 mg 抗坏血酸溶于 50 mL 无氨蒸馏水中随配随用。 5. 10 乙酸。 三仪器设备 分光光度计分析天平研钵容量瓶试管移液管水浴锅三角瓶漏斗。 三、实验步骤 1. 样品制备 取新鲜植物样品洗净、擦干并剪碎、混匀后迅速称取 0.5 1.0 g 于研钵中加入 5 mL 10 乙酸研磨匀浆后用蒸馏水稀释至 100 mL 。混匀并用干滤纸过滤到三角瓶中备用。 2. 制作标准曲线 取 6 支 20 mL 刻度试管按表 27 – 1 操作。 表 27-1 制作游离氨基酸标准曲线各试剂量及操作程序 试 剂 管 号 1 2 3 4 5 6 标准氨基酸 mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 无氨蒸馏水 mL 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 水合茚三酮 mL 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 抗坏血酸 mL 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 每管含氮量 μ g 0 1 2 3 4 5 加完试剂后混匀盖上大小合适的玻璃球置沸水中加热 15 min 取出后用冷水迅速冷却并不时摇动使加热时形成的红色被空气逐渐氧化而褪去当呈现蓝紫色时用 60 乙醇定容至 20 mL 。混匀后用 1 cm 光径比色皿在 570 nm 波长下测定吸光度以吸光度为纵坐标以含氮量为横坐标绘制标准曲线。 3. 样品测定 吸取样品滤液 1.0 mL 放入 20 mL 干燥试管中加无氨蒸馏水 1.0 mL 其他步骤与制作标准曲线相同。根据样品吸光度在标准曲线上查得含氮量。 四、结果计算 按下式计算样品中氨基态氮的含量。 式中 C ——从标准曲线上查得的氨基态氮含量 μg 。 V T ——样品稀释总体积 mL 。 V S ——测定时样品体积 mL 。 W ——样品鲜重 g 。 思考题 1. 茚三酮与所有氨基酸的反应产物颜色都相同吗 为什么 2. 抗坏血酸在测定中的作用是什么 【 附注 】 1. 茚三酮重结晶的方法 合格的茚三酮应该是微黄色结晶若保管不当颜色加深或变成微红色必须重结晶后方可使用。其方法如下 5 g 茚三酮溶于 15 mL 热蒸馏水中加入 0.25 g 活性炭轻轻摇动溶液太稠时可适量加水 30 min 后用滤纸过滤滤液置冰箱中过夜后即可见微黄色结晶析出用干滤纸过滤再用 1 mL 蒸馏水洗结晶一次置于干燥器中干燥后贮于棕色瓶中。 2. 茚三酮与氨基酸反应所生成的 Ruhemans 紫在 1 h 内保持稳定故稀释后尽快比色。 3. 空气中的氧干扰显色反应的第一步。以抗坏血酸为还原剂可提高反应的灵敏度并使颜色稳定。但由于抗坏血酸也可与茚三酮反应使溶液颜色过深故应严格掌握加入抗坏血酸的量。 4. 反应温度影响显色稳定性超过 80 ℃溶液易褪色可在 80 ℃水浴中加热并适当延长反应时间效果良好。 5. 谷物籽粒等含蛋白质的样品可用酸水解法将蛋白质水解后用本法测定水解液中的氨基酸含量可计算出样品蛋白质含量。下载本文