已有 2975 次阅读 2008-6-19 10:43 |个人分类:生活点滴 

蛋白质印迹（Western blotting）方法原理和优化

抽滤

　　抽滤是一种直接将蛋白质转移到膜上的方法。利用真空使溶解的样品滤过膜，蛋白质吸附到膜上，同时样品中其它成分被真空抽走。另外，也可直接将样品点在膜表面使之干燥。随后可对固定在膜上的蛋白质进行分析。

　　点印记和狭缝印记是抽滤方法的两种变型，用多支管装置将样品加到膜上成点状或狭缝图样。这些方法可用于快速定性筛选大量样品或定量分析类似样品，尤其是测试复杂分析中实验参数的适用性。

　　另一种抽滤方法的变型是格栅免疫印迹，这种方法适用于高度平行的样品分析，当样品量及其优先并且不能用常规方法如ELISA进行分析时使用。格栅免疫印迹可用于表征变态反应原-特异性抗体应答，只需最小量的病人血清。

当准备抽滤印迹膜时，要考虑以下方面：

　　去污剂可以抑制蛋白吸附到膜上。用于样品溶解和漂洗的缓冲液所含去污剂不应超过0.05%，并且仅当必要时才能加入。

　　样品体积应足以覆盖每个孔中的膜面积，但所含蛋白量不应超过膜的结合能力。

　　含较多颗粒的样品可能堵塞膜孔，而高黏度样品将降低流速。所以在结合前先通过预过滤或离心除去颗粒，只将上清加到膜上。而粘性样品要用缓冲液稀释。

Western印迹

Western印迹含一系列步骤，包括：

 用聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白样品。

 将胶上的蛋白转移到膜上。

 鉴定膜上特定蛋白。

下面将从理论和实践方面讨论Western印迹方法。

用1-D或2-D凝胶分离复杂蛋白质混合物

　　印迹前分离复杂蛋白质混合物的最常见方法是一维（1-D）SDS-PAGE电泳，它根据蛋白质的分子量进行分离。有时用非变性电泳分离天然蛋白质。尽管这种方法通常缺乏变性电泳的分辨率，但当蛋白须保留生物活性时非常有用。

　　二维（2-D）凝胶电泳用于分析细胞、组织、和体液蛋白质的组成，是现代蛋白质组学的关键技术。2-D免疫印迹可提供分子量和等电点信息，并可用于区分翻译后修饰产生的不同蛋白质形式。有些情况下只进行1-D电泳分离也可用免疫印迹对蛋白分型。

分子量标准

　　在凝胶中加入分子量标准或标记物可以在电泳分离后估计感兴趣蛋白质的大小。有两种类型的分子量标准：未染色和预染色。未染色分子量标准通常由天然或重组的纯化蛋白混合物组成。在凝胶或膜上显示其位置需要染色步骤。预染标准允许在电泳过程中监测蛋白分离，也可以在随后的印迹步骤中指示转移效率。然而，它们比较昂贵且加入染料会影响蛋白迁移率。预染标准在确定分子量时可能不够精确，并且蛋白质上附加的染料在转移时会影响它们吸附到膜上的能力。

聚丙烯酰胺浓度

　　凝胶中聚丙烯酰胺浓度可以是均一浓度或是梯度浓度。最常见的聚丙烯酰胺浓度为10%，最适合分离10-150KD范围内的蛋白质。若要分析未知蛋白或许要更宽的分离范围，推荐使用梯度胶。例如：4-12%Tris-glycine凝胶适合于30-200KD蛋白质的分离，而10-20%凝胶则能成功地分离6-15KD的蛋白质。SDS-PAGE凝胶通常为1.0到1.5mm厚；但蛋白转印最好使用更薄的胶。

凝胶电泳缓冲液

　　最常见的凝胶电泳缓冲液由Tris-甘氨酸或Tris-tricine组成。缓冲液可以包含0.1%去污剂，通常是SDS。Tris-甘氨酸凝胶可用于分离很宽分子量范围（6-200KD）的蛋白质，并可与变性或非变性条件相容。Tris-tricine最适于分离小分子蛋白质（<10KD）,加样之前还需要还原变性。两种缓冲系统都与蛋白质转印PVDF膜兼容。Tris-乙酸缓冲液有时被用来分离大分子蛋白。

将蛋白质从凝胶转移到膜

　　蛋白质从凝胶转移到膜上的过程中同时保持它们的相对位置和分辨率，这被称为印迹。印迹可以以三种不同的方式实现：

　　简单扩散：将膜放在凝胶上，同时放一沓干滤纸在膜上，并在滤纸上放置重物以加快扩散过程。这种方法可用于将蛋白质从一块凝胶上转移到多个膜上，同一凝胶可得到几个印迹膜。扩散法的主要缺点是不能定量转移，与电转比较只能转移25-50%的蛋白质。

　　真空辅助溶剂流动：用泵的吸力将分离的蛋白质从凝胶转移到膜上，高低分子量的蛋白质都可以用这种方法转移；然而，分子量小于14KD的蛋白质需要用较小孔径的膜（0.2um），因为它们不易被0.45um膜吸附。很少从聚丙烯酰胺凝胶中真空转印蛋白质，而从琼脂糖中转移核酸则常用此法。

　　电洗脱或电转移：最常用的转移方法，与扩散或真空印迹相比，其主要优点是速度和转移更完全。

电转移方法

　　两种常用的电转移方法是湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。

　　湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。另外用这种方法转移2-D电泳中常规使用的大胶比较困难。湿转系统一般在恒压条件下进行，转移过程中混合缓冲液保持电流相对恒定。

　　半干转移，用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。因为电极板直接与滤纸接触，使凝胶中电场强度尽可能大以快速高效转移。与湿转相比，这种方法又快（15-45分钟）又好。多数半干转移方法使用一种以上的缓冲系统，可以同时高效转移大小不同的蛋白。然而，半干印迹系统因缓冲液较少不适于较长时间转移。对于大2-D胶的印迹，半干转移是理想选择。半干印迹仪一般使用恒流条件，转移过程中电压逐渐增加。半干转移系统中，滤纸和膜切成和凝胶相同大小，这样电流必须通过凝胶，否则，在凝胶边缘处滤纸重叠将导致电流短路。两种转移系统中都必须注意防止在滤纸、凝胶和膜之间的任何地方存在气泡。气泡阻碍转移并在印迹膜上产生“秃斑”（即非转移区）。

转移缓冲液

　　转移缓冲液提供电极之间的电连接，必须能够导电。同时它也提供一种化学环境保证蛋白溶解，而不需担心蛋白质在转移过程中不能吸附到膜上。常规配方可满足多数蛋白样品的需要。多数缓冲液在转移过程中产生热量。针对此原因，很多湿转装置配备嵌入式冷却线圈。湿转也可在冷室中进行，缓冲液使用前可预冷。半干转移中电极板起到散热器功能。但它们的散热能力有限，一般半干转移不能进行太长时间。

　　传统转移缓冲液由缓冲系统和甲醇组成。Towbin缓冲液，一种Tris-甘氨酸缓冲液，常用于湿转系统。该缓冲液PH为8.3，比大多数蛋白质的等电点（pI）要高。蛋白质带净负电荷并向阳极迁移。因为缓冲液在槽中混合，转移过程中离子分布相对稳定。

　　半干系统使用三缓冲液系统。使用三种缓冲液是因为转移是等速电泳过程，蛋白质在前导离子和尾随离子之间迁移。三种缓冲液是：

 阳极缓冲液Ⅰ：0.3M Tris, PH 10.4

 阳极缓冲液Ⅱ：25mM Tris, PH 10.4

 阴极缓冲液：25mM Tris, 40mM ε-氨基乙酸，PH 9.4

　　阳极缓冲液Ⅰ中和阳极板表面产生的过量质子。阳极缓冲液Ⅱ含与阳极缓冲液Ⅰ相同的PH,但Tris浓度降低到25mM。阴极缓冲液含ε-氨基乙酸，转移过程中作为尾随离子，随着蛋白穿透凝胶迁移到阳极不断被消耗掉。通常不推荐用单缓冲液代替三缓冲液系统。单缓冲系统中整个凝胶转移有不一致的趋势，且经常转移不彻底。

尽管上述缓冲液系统适用于大多数蛋白转移，文献中还有很多适于不同应用的变化类型。最明显的变化之一是推荐10mM CAPS缓冲液（PH 11）用于蛋白质测序。在使用Edman化学法进行自动蛋白质测序时，Towbin缓冲液以及凝胶电泳缓冲液中的甘氨酸会引起高背景。改变缓冲液成分可以显著降低这种影响。对缓冲强度和组成的任何修饰都应非常注意，确保转移装置不会过热。

准备蛋白质鉴定膜

干燥

　　转移完成以后，在继续染色或免疫检测程序之前应将PVDF膜完全干燥。干燥可提高蛋白吸附到PVDF聚合物上的能力，有助于降低随后分析过程中的解吸。印迹膜干燥后就变得不透明了，这种光学变化是一种表面现象，可以掩盖截留在深部孔中的水分，应按照推荐时间干燥印迹膜，以确保所有液体从膜的孔结构中蒸发出来。蛋白转移后干燥的PVDF膜可长时间保存，这对膜没有不利影响（4℃可保存2周，-20℃可保存2个月，-70℃可保存更长时间）。然而，在非控制条件下长期保存可能使有些蛋白对化学变化（如氧化、脱酰胺、水解）敏感。推荐在低温下长期保存。一旦干燥后，在进行任何分析之前，应将膜在100%甲醇中浸泡润湿。

蛋白质显像

染色

染色是显示印迹膜上蛋白质的一种简单方法。染色可用于：验证蛋白质已经转移到膜上，确定各泳道加样量是否相等

评价整体转移效率，尤其是使用新缓冲液系统或蛋白样品时。有多种染料可以使用，如有机染料（丽春红、酰胺黑、坚牢绿、考马斯亮蓝），荧光染料（荧光胺、香豆素）和胶体微粒（金、银、铜、铁或印度黑墨汁）。这些染料可分为可逆和不可逆染料。通常不可逆染料的灵敏度最佳，但它干扰或无法对蛋白进行进一步分析。不可逆染料的实例有酰胺黑和考马斯亮蓝。可逆染料尽管灵敏度较低，但它允许评估印迹膜后从膜上将其洗除。最常用的可逆蛋白染料是立春红。如果靶蛋白丰度太低，则无法用染色法检测到，但对于较高丰度蛋白，染色法通常可以体现蛋白的转移情况。

　　用于印迹膜的新荧光染料高度灵敏且可与下游免疫检测、Edman测序和质谱相容。在用显色、荧光或化学发光法进行免疫检测之前，可使用Sypro Ruby和Sypro Rose蛋白印迹染料(分子探针)，它们的灵敏度可达约12ng/带。

下表列出检测Western印迹膜上蛋白时最常用的染料：

Western印迹常用染料及其特性

　　透视是一种专用于PVDF膜的显像方法，它首先应用于Immobilon-P转印膜。该方法基于一种假设，即转移蛋白覆盖的PVDF膜部分能在20%甲醇中润湿，而周围未结合蛋白的PVDF膜区域则不能。PVDF膜润湿的部分变得可透光，可用背光显示蛋白带并拍照存档。下载本文