《生物技术大实验》期末考试
1、请介绍第三代核酸测序技术。
答:
第三代核酸测序技术的基本原理:基于纳米孔的单分子读取技术，英国牛津纳米孔公司成功研发出第三代基因测序技术。该测序技术读取数据更快、有望大大降低测序成本，改变个人医疗的前景。
当前，基因测序工作费时且昂贵，测序时，分子必须进行多次复制(这一步被称为扩增)，同时进行荧光示踪标记，这一过程会带来错误，因此，一个基因要被测序多次才能得到值得信赖的结果。此外，购买和操作测序仪器的费用也不菲，目前，测定一个完整的基因组需要上万美元。
在纳米孔测序技术中，DNA分子依靠被称为核酸外切酶的蛋白质以一次一个碱基的速度通过小孔。这个酶能清楚地区分出4个DNA碱基编码：A、C、G、T，也可以检测出该碱基是否被甲基化，一个单孔能在大约70天左右测定一个完整的基因序列。
第三代核酸测序技术优点:纳米孔技术不需要荧光标记物并且很可能不需要进行扩增，能直接并快速“读”出DNA，同时足够廉价，使进行大量重复实验成为可能。纳米孔公司已经研发出包含几百个纳米孔的芯片，该芯片可以用在一台机器上，快速且廉价地给大量DNA进行排序。
基因测序于上世纪70年代由弗雷德-桑格尔发明，他因此获得了诺贝尔奖，第一份人类基因草图于2001年绘制成功，花费了40亿美元。
第三代核酸测序技术展望:纳米孔公司总裁戈登-桑赫纳说，该技术预示了基因测序领域的一个跳跃变化，花费不到1000美元就可以完成一个基因测序。借助该技术，在未来5年内，测序费用将有可能降至500美元。到那时，基因测序可以成为英国国民健康保险制度的一部分，民营保险公司也支付得起。该技术也可以让医生使用DNA来预测并且预防诸如心脏病、糖尿病等疾病，更加有效地开药。
世界著名基因测序公司Illumina的总裁杰伊-弗拉特利称，10年后，每一个新生婴儿都会被“配备”完整的基因排序，费用不超过5000美元。
2、使用蛋白纯化系统对蛋白进行纯化时，常用哪几种层析方法，请分析它们的原理，比较它们的不同；
答:在分离分析特别是蛋白质分离分析中，层析是相当重要、且相当常见的一种技术，其原理较为复杂,主要有以下几种层析方法:
一、 吸附层析
1、 吸附柱层析
吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。
2、 薄层层析
薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。
3、 聚酰胺薄膜层析
聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。
二、 离子交换层析
离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离三、 凝胶过滤
凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。分子筛层析的分离精度不高,常用于分子大小相差悬殊的蛋白质的分离纯化或蛋白质溶液的脱盐。
羟基磷灰石层析基于羟基磷灰石对一些蛋白质的吸附作用进行分离。虽然羟基磷灰石层析应用有限,但其分离成本低,在对某些蛋白质如血浆铜蓝蛋白的分离有独到之处。
离子交换层析是早期蛋白质层析方法之一,目前仍被普遍使用。疏水作用层析、反相作用层析利用组份间疏水性的差异分离各组份。用于疏水作用层析、反相作用层析的固定相表明都带有疏水作用基团。不同的是,疏水作用层析固定相表明的疏水基团疏水性弱,一定盐浓度的蛋白溶液流过固定相时,蛋白质被吸附,然后以低盐水溶液作为洗脱剂进行洗脱。而反相作用层析固定相表明的基团疏水性强,蛋白质水溶液流过固定相时,蛋白质被吸附,然后用有机溶剂洗脱。疏水作用层析多用于大分子蛋白质的分离纯化。反相作用层析分离蛋白质时,蛋白质容易变性失活。一般用于小分子蛋白质、多肽和氨基酸的分析、分离。亲和层析是一种高效、快速蛋白质分离纯化技术。通常的层析方法都是利用蛋白质理化性质的差异来进行分离的,这种差异往往并不是很大,所以,分离精度不高。亲和层析利用蛋白质分子与某一分子专一可逆结合的生物特性,来选择分离目标蛋白质。亲和层析容量大,分离效率高,且对目标产物的生物活性起到一定的保护作用。
3、大肠杆菌系统表达外源基因必须具备的条件？
答:大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛的表达系统，由于待表达的外源基因结构具有多样性，尤其是真核生物基因的结构与大肠杆菌基因结构之间存在较大的差异，因 而在构建表达系统时必须具体情况具体分析。一般来说，大肠杆菌系统表达外源基因必须具备的条件：
①优化表达载体的设计。为了提高外源基因的表达效率，在构建表达载体时对决定转录起始的启动子和决定 mRNA 翻译的SD序列进行优化。具体方法包括组合强启动子和强终止子；增加 SD 序列中与核糖体 16S rRNA 互补配对的碱基因序列，使 SD 序列中6～8 个碱基与核糖体16S rRNA 的碱基完全配对；根据待表达外源基因的不同情况调整 SD 序列与起始密码子 ATG 之间的距离及碱基的种类；防止核糖体结合位点附近序列转录后形成“茎环”二级结构。
②提高稀有密码子 tRNA 的表达作用。多数密码子具有简并性，而不同基因使用密码子的频率不相同。大肠杆菌基因对某些密码子的使用表现了较大的偏爱性，在几个同义密码中往往只有一个或两个被频繁地使用。如编码 Pro 的密码子包括 CCG、CCC、CCU 和CCA 等，而其中的表达系统。第一个密码子在大肠杆菌的基因中都高频地出现，而另外三个密码子出现的频率很低。同义密码子使用的频率与细胞内相应的 tRNA 的丰度呈正相关，稀有密码子的 tRNA在细胞内的丰度很低。在 mRNA的翻译过程中，往往会由于外源基因中含有过多的稀有密码子而使细胞内稀有密码子的 tRNA供不应求，最终使翻译过程终止或发生移码突变。此时可通过点突变等方法将外源基因中的稀有密码子转换为在受体细胞中高频出现的同义密码子。
③提高外源基因 mRNA 的稳定性。大肠杆菌的核酸酶系统能专一性地识别外源 DNA或 RNA并对其进行降解。对于 mRNA 来说，为了保持其在宿主细胞内的稳定性，可采取两种措施，一是尽可能减少核酸外切酶可能对外源基因 mRNA的降解，二是改变外源基因 mRNA 的结构，使之不易被降解。
④提高外源基因表达产物的稳定性。大肠杆菌中含有多种蛋白水解酶，在外源基因表达产物的诱导下，蛋白水解酶的活性可能会增加。因此，须采用多种措施提高外源蛋白在大肠杆菌细胞内的稳定性。常用的方法包括：将外源基因的表达产物转 运到细胞周质或培养基中；选用某些蛋白水解酶缺陷株作为受体菌；对外源蛋白中水解酶敏感的序列进行修饰或改造；在表达外源蛋白的同时，表达外源蛋白的稳定 因子。
⑤优化发酵过程。由于细菌在 100L 以上的发酵罐中的生长代谢活动与实验室条件下200mL 摇瓶中的生长代谢活动存在很大差异，在进行工业化生产时，工程菌株大规模培养的优化设计和控制对外源基因的高效表达至关重要。优化发酵过程既包括工艺方面 的因素也包括生物学方面的因素。工艺方面的因素如选择合适的发酵系统或生物反应器，目前应用较多的有罐式搅拌反应器、鼓泡反应器和气升式反应器等。生物学 方面的因素包括多方面，首先是与细菌生长密切相关的条件或因素，如发酵系统中的溶氧、pH 值、温度和培养基的成分等，这些条件的改变都会影响细菌的生长及基因表达产物的稳定性。生物因素的第二方面是对外源基因表达条件的优化。在发酵罐内工程菌 生长到一定的阶段后，开始诱导外源基因的表达，诱导的方式包括添加特异性诱导物和改变培养温度等。使外源基因在特异的时空进行表达不仅有利于细胞的生长代 谢，而且能提高表达产物的产率。生物因素的第三方面是提高外源基因表达产物的总量。外源基因表达产物的总量取决于外源基因表达水平和菌体浓度。在保持单个 细胞基因表达水平不变的前提下，提高菌体密度可望提高外源蛋白质合成的总量。
4、简述PCR技术的基本原理、过程及反应体系的组成成份。
答:PCR(polymerase chain reaction),聚合酶链式反应是近年来发展起来的体外扩增特意DNA片段的一种方法或技术,又称体外DNA扩增技术。
PCR技术的原理： 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸序列--引物。以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。
PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：
1. 变性 (Denaturation)：
加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。94℃ 30″。Tm值（Melting temperature）：DNA双链解离一半时的温度叫解链温度（ Tm ）。不同的DNA解链温度不同，一半认为Tm随G-C含量增加而升高， G-C含量每增加1%， Tm提高0.4 ℃ 。 Tm范围常在85-95度之间。
2. 退火 (复性) (Annealling):突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。55-65 ℃ 30 ″。
3. 延伸 (Extension):将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，从引物的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链。72 ℃ 1-5′。
PCR反应体系的组成成份:1. 缓冲液：10 ～ 50 mM Tris- Cl (pH8.3)维持 Taq 酶作用环境的偏碱性;25 ～ 50 mM KCl促进引物退火，>50 mM 会抑制 Taq 酶的活性;100μg / ml 牛血清白蛋白 (BSA)对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作用，建议使用乙酰化的 BSA。明胶、Tween-20、二硫苏糖醇 (DTT) 也有类似作用。2. MgCl2:1.5 ～ 2.0 mM,Taq 酶具有 Mg2+依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量，过量能增加非特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下降。3. dNTPs : dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP——底物0.02 ～ 0.2 mMdNTPs 可与 Mg2+ 结合，应注意Mg2+ 浓度与dNTPs 浓度之间的关系。过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入率和室验成本。过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。4.引物 (Primer-P)：预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。0.2 ～ 1 μM偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间形成引物二聚体，产量降低。偏低：产量降低。5. Taq DNA 聚合酶：耐高热0.5 ～ 5 U / 100 μl偏高：引物非特异产物的扩增;偏低：产物量降低。PCR扩增片段的长度范围，可从数百个至数千个碱基，但实际上还受到Taq DNA 聚合酶作用范围的影响。普通的Taq DNA 聚合酶有效扩增范围在2kb左右，扩增1kb之内的DNA片段效率最高。当使用长片段Taq DNA 聚合酶时，也可扩增20kb以上的DNA大片段。
5、试述细胞转染的基本方法及原理。
（以上每题20分，共计100分）
答:细胞转染(cell transfection)：是指将具有生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使其（核酸）在细胞内维持其生物学功能。它是研究基因表达，突变分析等的常规工具。
基因转染的基本方法:根据转染的机制（原理）不同可将转染法分为：
1.物理介导方法：（1）电穿孔法：将外源基因通过电场作用导入动物组织或器官细胞中的技术 。利用高压电脉冲对细胞膜的干扰（打孔），使其形成利于核酸进人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便地用于悬浮细胞，重现性好，但要求细胞数量大。影响转染效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。（2）显微注射法：用显微操作仪将DNA直接注入靶细胞。需要特殊的仪器装置，技术要求高，并且操作繁琐，转染细胞数有限，不适于大规模操作，多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞 。（3）基因：又称生物弹法或微粒法、微粒轰击法，是依赖高速度的金属颗粒将外源基因引入活体细胞的一种转染技术。基本原理：经适当处理后，使DNA液均匀地吸附在或包裹于微小的钨粉或金粉颗粒表面，利用基因的火药爆炸（火药式）、高压放电（电动式）或高压气体（气动式）作驱动力，发射出微弹与DNA的复合体，击中并高速穿透真空室中受体细胞的细胞壁及细胞膜，进入细胞内，从而达到将吸附于微弹上的外源DNA导人细胞或原生质体，获得整合与表达的目的 。
2. 化学介导方法：(1)DEAE-葡聚糖:二乙氨乙基葡聚糖(diethyl-aminoethyl-dextran)，简称DEAE-葡聚糖，是一种高分子量的多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源的DNA，实现瞬时转染。原理：其原理还不清楚，可能是带正电的DEAE-葡聚糖与带负电的核酸相互作用形成的复合物被细胞内吞噬而使DNA 转导进入细胞核。转染效率与DEAE-葡聚糖浓度以及细胞与DNA /DEAE-葡聚糖混合液接触时间的长短很有关系。(2) 磷酸钙共沉淀转染法：由Graham和Van der Eb于1973年首次提出，现仍广泛应用。原理：先将DNA和氯化钙混合，然后加入到磷酸盐缓冲液中慢慢形成极小的磷酸钙-DNA复合物沉淀，把含有沉淀的混悬液加到培养的细胞上，磷酸钙-DNA复合物沉淀黏附在细胞膜表面，通过胞膜的内吞作用进入细胞质。(3)脂质体法：脂质体(Liposomes)是一种人造的脂质小泡(lipid vesicles)，外周是脂双层，内部是水腔 。用它作载体可以把外源DNA导入培养的哺乳动物细胞。原理：中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。 阳离子脂质体与带负电荷的核酸结合后形成合物，当复合物接近细胞膜时被内吞成为内体进入细胞质，随后DNA复合物被释放进入细胞核内。
3.生物介导方法:(1)原生质体转染;(2)病毒介导的转染法：以病毒作为载体,通过病毒感染的方式将外源DNA 导入到细胞中, 其中以逆转录病毒（包括慢病毒）及腺病毒转染系统最为常用。下载本文
