《发酵工程基础实验》实验论文  

班级        学号        姓名           成绩 ________

开课学院  生工学院    任课教师  李友元 

论文题目：

朱理﹡，周文茹，陈鹏飞

华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237

摘　要  优良的菌种是发酵工业的基础，工业生产的菌种一般都需要运用遗传学原理和技术进行改造，从而使得现存的优良性状强化，去除不良性状，提高菌种的生产能力。本实验从洁霉菌的单孢子悬浮液出发，采用紫外诱变选育菌株，经过种子扩陪、发酵培养后，最终用杯碟法对产物进行分析,并与原菌种进行比较。实验测得紫外诱变的平均死亡率为%，诱变后效价值为。并与其他实验组进行比较得，诱变剂量不同即紫外照射时间不同，会直接导致菌体的死亡率不同，且诱变剂量越大即紫外照射时间越长，则菌体死亡率越高。

关键词  洁霉菌,  紫外诱变， 死亡率， 糖氮测定， 效价，

中图分类号　T文献标识码　A文章编号

The Ultraviolet Mutagenesis and Fermentation of of S. Lincolnensis

ZHU Li﹡，ZHOU Wen-Ru，CHEN Peng-Fei

State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, ECUST, Shanghai 200237, China

Abstract  The good strain is the basis of the fermentation industry, industrial production strains generally requires the use of genetic principles and techniques to improve the characteristic, in order to make the existing good traits to strengthen, remove the undesirable traits, and increase the production capacity of the strain. In the research, S..lincolnensis was mutated by UV. After scale-up and fermentation,we determined the potency by cylinder-plate method, then compared with the initial strain. Finally，We matured the death rate is about %，the podency of mutated strain＇s efficiency was  compared with other group, different UV radiation times cause different mortality, the greater UV radiation time, the higher mortality.

Key words  S. lincolnensis , UV mutation , mortality , potency     

洁霉菌(S. lincolnensis,)，又名林可链霉菌，它可产生林可霉素(1incomycin)，一种林可胺类碱性抗生素，对多数的革兰氏阳性菌有较强抗菌活性，是临床用主要抗生素之一[1]。但链霉菌中普遍存在遗传不稳定性，从而引起抗生素产量下降。因此各国学者不断研究提高抗生素产量的方法，已期获得更大产量的抗生素，而提高产量的最重要途径是通过育种改变生产菌种。诱变育种是一种简便易行而且快速的选育方法 因而在抗生素的菌种筛选中应用最广泛。[2]

本文对林肯链霉菌进行紫外诱变，以期获得较高产量的林可霉素产生菌。并进行不同诱变时间的处理，比较死亡率与诱变后洁霉素生物效价的变化。

1　材料和方法

  菌种

洁霉菌；藤黄八叠球菌（均由华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室提供）。

  仪器与材料

1.2.1 实验仪器

250ml三角瓶；150ml三角瓶；15×150试管；双碟：直径9cm、直径5cm；涂布棒；1ml吸管；5ml吸管；粗口吸管15ml、5ml各一支；电子天平；无菌磁力搅拌子；微量移液器；接种环；不锈钢管（外径8±0.1mm、内径6±0.1mm、高10±0.1mm)；陶瓷瓦盖；滴管；镊子等。

1.2.2 实验设备

紫外照射箱：它是一台装有15瓦紫外灯管以及磁力搅拌器的带有可控样品进出口的封闭的装置、灯管与磁力搅拌器的距离（即照射距离）为30cm；旋转式摇床一台：其转速为230 r/min；离心机；灭菌锅；超净工作台等。

1.2.3 试剂

 洁霉素标准溶液：效价分别为5μ/ml和μ/ml；pH 的磷酸缓冲液（KH2PO4  0.41g 和K2HPO4 5.59g加蒸馏水1000ml）；蒸馏水；费林试剂；6mol/L NaOH；L NaOH;6mol/L HCl；1mol/L HCl；Na2S2SO3标准液；1%淀粉指示剂；甲基红指示剂；酚酞指示剂；12%中性甲醛。

1.2.4 培养基配方

表1  培养基配方

Table 1  Culture medium formular

1.3.1 洁霉菌单孢子悬浮液的制备

取已培养好的洁霉菌孢子斜面（500ml的扁瓶）一只，加入40ml无菌水，把孢子轻轻刮下，将其倒入已灭菌盛有玻璃珠的三角瓶中，振荡20min，用带有无菌脱脂棉的漏斗过滤，即得分散较好的单孢子悬浮液。

1.3.2 培养方法

平板培养：接菌种于平板培养基，倒置放入28℃培养箱中，培养5-7天。

斜面培养：将生长好的、孢子丰满的、没有染菌的单菌落挑入斜面，放入28℃培养箱中，培养7天。其中对照菌种挑一支，处理菌种挑三支。

摇瓶发酵培养：将培养好的洁霉菌斜面挖一小块接入发酵培养基，在30℃、转速230 r/min的旋转式摇床上培养7天。其中对照菌种接一只摇瓶，处理菌种接三只摇瓶。

1.3.3 诱变育种

图1 诱变育种流程图

 Flow diagram of mutation breeding

1.3.4 分析方法

死亡率：平板菌落计数法

糖氮含量测定：斐林试剂法

氮含量测定：甲醛法

洁霉素效价：杯碟法（两剂量法）

2  实验结果

2．1 紫外诱变结果

本实验中诱变剂量仅取决于紫外照射时间，分别选用了紫外照射20s和40s，死亡率用平板菌落计数法计算。实验结果如表2、表3所示。

紫外照射死亡率=（对照组菌落数-诱变组菌落数）/对照组菌落数×100%

死亡率（20s）=×105－×105)/（×105）×100%=%

死亡率（40s）=(7×105+×105－××105)/(7×105+×105)=%

诱变剂量不同即紫外照射时间不同，会直接导致菌体的死亡率不同，且诱变剂量越大即紫外照射时间越长，则菌体死亡率越高。

表2 紫外诱变结果（20s）

Table 2  Results of UV mutagenesis(20s)

各取发酵上清液，分别用菲林试剂法和甲醛法测定。实验数据如表4、表5所示。

表3 紫外诱变结果（40s）

Table 3  Results of UV mutagenesis(40s)

Table 4  The results of total sugars ＆ ammonia nitrogen content(20s)

Table 5  The results of total sugars ＆ ammonia nitrogen content(40s)

总糖含量=（V2-V1）/3×4= （）/3×4= %

氨氮含量=V3×20= ×20= ㎎/100ml

经测定，糖氮含量分别为 %、 ㎎/100ml，可知培养基营养成分较为丰富。

40s：

总糖含量=（V2-V1）/3×4= （）/3×4= %

氨氮含量=V3×20= ×20= ㎎/100ml

发酵放瓶结果

经过发酵培养后，进行发酵放瓶，观察各瓶发酵液的外观、颜色、气味、稠度、是否染菌等，用精密pH试纸测定pH，初步判断摇瓶生产情况。实物图见图2，放瓶结果见表6。

实验中，观察到2号、3号诱变组和4号实验组摇瓶的液体并无大致差异，而1号摇瓶中液体呈深褐色，与其他三个摇瓶有显著不同，并且仔细观察摇瓶中的液体，发现呈酸性且黏度较低，所以我们组成员觉得1号摇瓶可能污染了杂菌，导致发酵现象不同。

图2 发酵结果图。从左至右，摇瓶标号依次为1、2、3、4。

 The result of the final fermentation. From left to right, the number of shake flask is 1,2,3,4,respectively

表6 发酵放瓶结果分析表

Table 6  The result of the final fermentation

取直径9cm的碟子，摊铺好底层和菌层之后，子均匀放置4个钢管（如图3所示），分别注入等量的高浓度样品、低浓度样品、高浓度标准液、低浓度标准液。量取抑菌圈大小，用两剂量法计算洁霉素生物效价。

由公式 

θ—为样品浓度与标准品浓度的百分数

K—高低浓度之比，本实验设定为2

V=（UH + UL）-（SH + SL）

W=（UH + SH）-（UL + SL）

实际单位=θ×估计单位

样品的估计单位为1000U/ml。

实验结果见图4，实验数据及计算结果如表7、表8所示。

表7 抗生素效价测定结果（20s）

Table 7  The podency of the antibiotic(20s)

序号   处理类型         抑菌圈直径/㎝              效价/u        平均值/u     

Table 8  The podency of the antibiotic(40s)

序号   处理类型        抑菌圈直径/㎝               效价/u        平均值/u     

图3 钢圈放置位置示意图                               图4 杯碟法结果图

Fig. 3 Diagram of the placedrims’location                 The results of cylinder plate method

3  分析与讨论

实验结果：经测定，紫外诱变的平均死亡率为%，消后发酵培养基糖氮含量分别是 %、  ㎎/100ml，培养基营养成分较为丰富。诱变后菌株的平均效价是，较对照组洁霉素效价明显上升。

死亡率

死亡率与诱变率有密切联系，而实验测出死亡率所耗时间短，可较早了解照射剂量是否合适。本实验中紫外波长、照射距离是相同的，因此诱变剂量仅与照射时间有关。通过对照组、处理20s组和处理40s组的对比可知，不同即紫外照射时间不同，会直接导致菌体的死亡率不同，且诱变剂量越大即紫外照射时间越长，则菌体死亡率越高。

这其中存在一最适诱变剂量，一般照射剂量以照射后微生物的致死率为90%~%的剂量为最佳照射剂量，偏低的计量处理后正突变较高，而用较高的剂量时则负突变率较高，但高剂量造成损伤大、回复少。目前多采用低剂量长时间处理，尽管致死率较高，但诱变效果好。[3]

在实验中，本组采用了紫外照射20s，计算得到的死亡率为%。此数值偏低，可能有以下几个原因：

（1）紫外照射时间过短；

（2）诱变组从紫外箱中取出后，未进行遮光处理，菌体可能发生了光修复作用，影响死亡率的测定；

（3）稀释倍数为104那组，平板所得菌落数较少，存在偶然误差，不利于用于计数计算。

 营养成分含量

控制营养成分的充足及碳氮平衡有利于维持菌体的正常代谢活动。本次的洁霉素发酵培养基中使用了黄豆饼粉、玉米浆等天然原料，成分复杂，通过测量糖氮含量可为日后培养基的优化及发酵过程中的补料操作提供依据，也可增加实验的可重复性。

但实验中发现一现象：同一大组的发酵培养基同时配制，但测得的糖氮含量却不同，可能部分未溶解的颗粒分装不均所致。

洁霉素生物效价

在生物效价的测定中，抑菌圈大小与抗生素效价的关系为：

抗生素的总量的对数值与抑菌圈半径的平方呈正比。此外还受C、H、D、T的影响，这些可用两剂量法消去。

本实验所选用的杯碟法受以下因素影响：[4]

（1）培养基厚度

效果：H越大，其它条件相同时r越小。

影响H的因素：培养基；小钢管的放置及重量

（2）细菌生长到肉眼所需的时间

效果：T越大在其它条件相同时，r越大

影响T的因素：菌体本身，及影响菌体生长的条件.如：接种量，培养温度、及营养环境

（3）最低抑菌浓度C

效果：C越大在其它条件相同时，r越小

影响C的因素：抗生素（本身、缓冲液）；试验菌；培养基

（4）扩散系数D

效果：D越大在其它条件相同时，r越大

影响D因素：抗生素及缓冲体系；培养基的成分；温度；钢管的质量及放置

而在本实验操作中，主要影响的有培养基厚度、钢圈的放置、抗生素剂量、菌体浓度。

4  感想与建议

发酵实验将发酵过程按工艺流程安排了培养基配制、菌种 诱变、种子扩陪、发酵培养、产物分析五大单元实验模块，使我们较好的掌握了基础实验技巧，也较为全面的了解了发酵工艺过程。发酵实验课上新颖的flash课件、生动的实验视频和神奇的随机点名系统，调动了同学们的积极性。实验课后的每次清洁为我们的实验提供一个良好的环境。这些都使本学期的实验严谨但不失趣味。

实验操作方面我也学到很多。首先看到同学们纷纷染菌，让我意识到微生物实验不像以往的化学实验，无菌操作的保证是整个实验成功的基本保障。此外，溶解淀粉时应先用冷水摇匀再加热，以免淀粉糊化；测生物效价时，菌体浓度在试管中稀释后应先摇匀再吸取，否则在菌体生长不旺盛，使得抑菌圈的边缘不清晰，影响测量；效价培养基厚度需要均一，钢圈的放置要轻且稳，这些熟练的操作需要我们在日后的实验中逐渐培养。

以下是我的几点建议：

（1）在条件允许的前提下，同一大组可用不同的方法测量糖氮含量和生物效价，如酶试剂盒法、化学法等。同学们可进行数据共享，这样不仅可以提高测量的准确性，也让大家对不同的方法有一个比较。

（2）在诱变处理中，可适当再延长一些诱变时间，增大发生负突变的几率，使大家对诱导突变的随机性和盲目性有一个感性认识。

（3）实验的打分不宜将大部分得分放在实验报告的撰写上，可增大实验操作的分值，毕竟实验课在于培养同学们的实际操作能力。

最后，诚挚的感谢、杨老师对我们实验的辛勤指导，以及1-18组的同学慷慨地与我们分享数据！

REFERENCES（参考文献）

[1] 薛正莲, 王洲, 张相美 等. 紫外-激光复合诱变原生质体选育林可霉素高产菌株[J], 激光生物学报, 2010, 19(6): 838-842

[2] 陈立梅, 汪旭, 李启云 等. 链霉菌诱变育种方法综述[J], 吉林农业科学, 2006, 31(2):62-

[3] 丁琳. 复合诱变选育林肯霉素高产菌株[J]. 氨基酸和生物资源, 2006, 28(4): 68~70

[4] 俞俊棠, 唐孝宣, 邬行彦, 李友荣 等. 新编生物工艺学[M]. 化学工业出版社, 2003年37-40, 108-112

[5] 陈长华, 宫衡, 高淑红.发酵工程实验[M]. 高等教育出版社, 2009年48-50, 161-163, 184-185, 192-193下载本文