Journal of Northwest Forestry University
核桃属植物内生真菌的分离及其抑菌活性研究
翟梅枝1,问小强1,刘 枫1,高智辉1,张亚丽2
(1.西北农林科技大学林学院,陕西杨陵712100;2.安徽农业大学茶与食品科技学院,安徽合肥230036)
摘 要:以核桃、黑核桃作为供试材料,从其茎、叶和青皮中分离得到60株真菌,经确认为其内生真菌。对这些内生真菌的培养滤液抑菌活性研究表明:核桃和黑核桃的内生真菌有广泛的抗菌谱,对棉花立枯病菌、苹果炭疽病菌、梨黑星病菌、小麦赤霉病菌和油菜菌核病菌菌丝生长具有抑制作用。
关键词:核桃;内生真菌;抑菌活性
中图分类号:S759.34 文献标识码:A 文章编号:100127461(2009)0320144204 Isolation of Endop hytic Fungi f rom Walnut and Their Antif ungaul Activities
ZHAI Mei2zhi1,WEN Xiao2qiang1,L IU Feng1,G AO Zhi2hui1,ZHANG Ya2li2
(1.College of Forest,N ort hwest A&F Universit y,Yangling,S haanx i712100,China;
2.College of Tea&Food Science and Technolog y,A nhui A gricult ural Universit y,Hef ei,A nhui230036,China)
Abstract:60st rains of endop hytic f ungi were isolated f rom stems,leaves and green husks of J u gl ans regi a L.and J.ni g ra,and t heir antif ungal activities were tested.The result s showed t hat t hese endop hytic f ungi had a broad antibiotic spect rum and showed antif ungal activities to T hanatep horus cucumeri, Glomerell a ci ng ul at a,V ent uri a pi ri na,Fusari um g rami nearum and S cleroti ni a sclerotiorum.
K ey w ords:walnut;endop hytic f ungus;antif ungal activity
近年来,植物病害的生物防治研究越来越受到人们的重视。从植物体获得的内生菌中发现具有农药活性的物质,成为无公害生物性农药创制的一条途径。核桃(J u gl ans regi a)和黑核桃(J.ni g ra)为核桃科核桃属植物,研究表明,核桃属植物次生物质本身具有抑菌、杀虫、抗病毒、除草等多种生物活性[1213]。为此,对2种核桃属植物的内生真菌进行分离、纯化,并对其培养滤液的抑菌活性进行初步研究,以核桃属植物的内生真菌为药源,为深度研究其代谢产物的活性成分,特别是具有新型分子结构和特殊作用机理的化合物奠定基础。
1 材料与方法
材料
1.1.1 植物材料 2007年8月,自西北农林科技大学林学院苗圃采集植物材料。取材部位为10a 生核桃与黑核桃的茎、叶、果实的青皮等健康组织,装入保鲜袋内,带回实验室备用。
1.1.2 培养基 内生真菌分离、纯化及测试菌培养基均为PDA固体培养基;发酵培养基为PDA去琼脂培养基(马铃薯200g,葡萄糖20g,水1000mL)。1.1.3 供试靶标真菌 棉花立枯病菌(Thanatepho2 rus cucumeri)、苹果炭疽病菌(Glomerella cingulata)、梨黑心病菌(Venturia pirina)、小麦赤霉病菌(Fusar2 ium graminearum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclero2 tiorum)均由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供。
方法
1.2.1 内生真菌的分离与纯化 分别刮去核桃、黑核桃茎外表皮后,用无菌水冲洗干净,剪成2cm×2 cm的小块,叶片经无菌水冲洗后剪成1.5cm×1.5 cm的小块。青皮切成长、宽均为2cm厚为1cm的小块。将以上材料在超净台内进行表面消毒,程序为:无菌水冲洗→75%酒精漂洗1min→无菌水冲
① 收稿日期:2008209208 修回日期:2008210208
基金项目:国家自然科学基金(30571494);中国博士后基金(20040356);西北农林科技大学优秀人才专项基金(04ZR005) 作者简介:翟梅枝,女,教授,博士,主要从事植物资源利用和植物病害防治研究。E2mail:plum2zhai@163.com。
洗3～4次→0.1%升汞漂洗2～3min→无菌水冲洗4～5次。在无菌条件下将处理好的材料在培养基上做组织印迹对照处理,检验消毒效果。
用消毒过的刀片将消毒后的茎表皮切成约0.5 cm长的小块;叶片取中心部分,切成长、宽约0.5 cm的小块;青皮切成长、宽、厚约0.5cm的小块。各处理分别移植于PDA平板培养基上,每皿3块,放置于28±1℃避光培养3～7d,待材料外缘切口出菌丝(菌落)即可进行纯化。纯化时,挑取菌落外缘少量菌丝的尖端部分,转接于新的PDA平板培养基上,经多次纯化后可得到单一菌株,对菌株编号后转接至试管中,培养至菌丝覆盖整个斜面,放入4℃冰箱中,保藏备用。
1.2.2 内生真菌的确认 将分离纯化的真菌菌株在PDA培养基上培养,培养15d左右产生孢子和子实体,在此期间观察菌丝的形态特征。对孢子及子实体进行显微观察,参考有关资料确定核桃是否有此病原菌。若为非病原菌,则在无菌条件下用无菌水将孢子冲下收集,对收集的孢子进行复侵染活性试验,涂抹孢子于健康无病害的核桃和黑核桃的幼叶上,继续观察其侵染发病与否。不能侵染发病者视为内生真菌。
1.2.3 内生真菌的液体培养 将确认的内生直菌菌株接种于PDA平面固体培养基上活化2次,待菌落长至直径40～50mm,在无菌条件下用直径为5 mm的打孔器沿菌落边缘打菌饼,用拨针接种至含150mL PDA液体培养基的500mL锥形瓶中,在28±1℃、170r・min-1摇床上震荡培养8d,作为种子培养基。将种子培养基接种至含200mL PDA液体培养基的500mL锥形瓶中(种子培养基用量为约1.5mL),同时留一瓶非接种的作为空白对照,在28±1℃、170r・min-1摇床震荡培养12～14d,取出过滤,滤液(发酵液)备用。
1.2.4 内生真菌的抑菌活性 在无菌条件下,量取一定量的无菌发酵液(对照用无菌水)与融化状态下的PDA培养基,在40～50℃下按1∶10混匀,倒入培养皿中(每皿10mL),凝固后接病原菌菌饼(直径5mm),处理、对照各重复3次。置于28±1℃培养箱内培养72h后,测量病原菌菌落直径,计算抑制率。
抑制率(%)=(对照菌落的直径-处理菌落的直径)/(对照菌落的直径-0.5)×100
2 结果与分析
内生真菌的分离确认
组织印迹对照结果显示,对照材料周围均无任何菌长出,表明表面消毒彻底,从而保证了所分离出的真菌是植物的内生真菌而不是空气中或组织表面附生的微生物。
从2种核桃属植物的各组织分离得到60株内生真菌,其中,从核桃中得到29株,占总数的48.3%;从黑核桃中得到31株,占总数的51.7% (表1)。经形态学观察和复侵染接种试验,初步确定分离得到的这些菌株为核桃属植物的内生真菌。形态学观察显示,2种核桃属植物中分离得到的内生真菌存在一定的重复,同种植物不同部位分离到的内生真菌也有相同,因此,核桃属植物内生真菌有一定的交叉重复性。其中,J1、Q6、HQ9与HQ10, J8、HJ12、H Y8与HQ7,J12、H Y6与HQ3,HJ11、H Y9与HQ8,J5与HQ6、J15与HJ10分别相同。
从表1可以看出,核桃、黑核桃各部位中内生真菌分布数量均为:茎>青皮>叶,表明茎为核桃、黑核桃内生真菌分布最多的部位,分别为15株和12株,占各分离菌株总数的51.7%和38.7%。核桃青皮中的内生真菌9株,占其总数的31.0%;叶中5株,占其总数的17.2%。黑核桃青皮和叶中的内生真菌数量基本相同,分别为10株和9株,占其总数的32.2%和29.0%。
表1 2种核桃属植物不同组织部位分离得到的内生真菌
Table1 The strain number of endophytic fungi at different positions from walnut
组织部位
核桃
内生真菌数目菌株编号
黑核桃
内生真菌数目菌株编号
茎15J1～J1512HJ1～HJ12叶5Y1～Y59H Y1～H Y9青皮9Q1～Q910HQ1～HQ10合计2931
内生真菌代谢产物对种植物病原菌的抑制作用
研究表明,60株内生真菌的培养滤液对5种供试病原菌均有一定抑制作用的有27株(表2),约占总数的45.0%;对4种植物病原菌有抑制作用的有46株,占总数的76.67%;对3种病原菌有抑制作用的有53株,占总数的88.33%;对2种病原菌有抑制作用的有5株,仅占总数的8.33%。Y1仅对苹
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第3期翟梅枝等 核桃属植物内生真菌的分离及其抑菌活性研究果炭疽病菌有较微弱的抑制作用;HJ8对5种病原
菌均无抑制作用。可见,核桃属植物的内生真菌具
有较广谱的抑菌效果。
表2 核桃属内生真菌培养滤液对5种植物病原菌的抑菌活性①
Table2 Antifungal activities of culture filtrate of endophytic fungi from walunt to five pat hogenic fungi 菌株编号
抑制率/%
油菜菌核病菌梨黑心病菌小麦赤霉病菌苹果炭疽病菌棉花立枯病菌J1-28.5712.87 4.08-
J242.5310.4231.8724.14100
J339.2752.3617.5926.5541.76
J4---8.3316.55
J553.5717.2914.8529.2322.45
J6-52.8666.3469.3940.00
J7-- 4.5410.1828.27
J8-65.7133.6622.4515.38
J960.2514.2820.6310.2021.54
J10-100100100100
J11-25.71-12.2410.77
J1216.80 5.5327.6717.2415.61
J13---10.1822.06
J1422.8116.9333.9624.1355.69
J1559.698.7926.6224.1328.27
Y1---9.25-
Y287.9944.6345.4956.90100
Y3-25.7132.5112.2410.77
Y426.0518.57 3.96 2.0415.38
Y538.3545.5450.1940.5346.38
Q142.1320.009.9012.2423.07
Q288.858.7928.7222.4153.58
Q357.1118.5650.7337.9381.01
Q4-17.5522.3432.65 6.15
Q5---10.1822.06
Q6-31.4217.7911.58-
Q7-16.518.4412.9634.48
Q8---10.1822.06
Q915.3617.14 6.1532.6556.27
HJ173.4149.5143.4053.45100
HJ210.7118.36-14.2930.77
HJ3-72.8683.1771.4356.92
HJ446.8213.6822.4329.31100
HJ5-17.258.9116.3210.76
HJ6- 1.73 5.1922.2235.17
HJ7-18.57 1.9816.329.23
HJ8-----
HJ969.1212.0540.2531.0391.56
HJ1058.539.2325.3923.8027.
HJ11-21.6611.0213.4324.55
HJ12-.1732.2321.3714.26
H Y1--- 4.6210.34
H Y286.2723.4538.1539.65100
H Y379.418.7933.9624.1336.70
H Y4-80.0092.8578.70100
H Y5-100100100100
H Y615.52 6.3226.5918.5616.78
H Y757.9721.8260.1632.7595.78
H Y8-63.2934.5123.3816.72
H Y9-20.009.9012.2423.07
HQ145.1118.58.6324.1366.24
HQ223.7615.4732.9322.3354.54
HQ317.69 4.9828.8316.6314.49
HQ4--9.749.2515.86
HQ539.1051.1416.1427.5940.93
HQ652.4616.2613.6728.3221.78
HQ7-66.2835.4520.2017.83
HQ8-19.2810.7911.5622.35
HQ9-32.8618.8110.20-
HQ10-16.8232.65 6.15-
①表中数据为3次重复平均值;“-”表示无活性。
60株内生真菌对5种供试植物病原菌的抑制作用具有一定差异。对棉花立枯病菌有抑制作用的有54株,占总数的90%,其中,抑制率在30%以上的有25株,占总数的46.29%,抑制率为100%的有
1西北林学院学报24卷 8株,分别是H Y5、H Y4、H Y2、HJ4、HJ1、Y2、J10、J2;对小麦赤霉病菌、梨黑星病菌有抑制作用的各有51株,占总数的85%,抑制率在30%以上的分别为23株和16株,占有抑制作用菌株的45.10%和31.37%;除HJ8外,其余59株对苹果炭疽病菌均有抑制作用,抑制率在30%以上的有15株,占有抑制作用菌株的25.42%;对油菜菌核病菌有抑制作用的仅有28株,其中抑制率在30%以上的有20株。约半数以上的核桃属植物内生真菌对油菜菌核病菌生长无抑制作用。
对5种病原菌抑制率都在20%以上的有5株,分别为Y1、Y5、HJ1、H Y2和H Y7;对4种病原菌抑制率都在20%以上的有22株,占总数的36.67%,其中,抑制率在30%以上的占一半,为11株,抑制率在40%以上的为7株,抑制率在50%和70%以上的分别为4株和3株(H Y5、H Y4和J10), H Y5和J10除对油菜菌核病菌无抑制作用外,对其他4种病原菌的抑制率均为100%,由此可以确定, H Y5和J10为活性较高、抑菌谱较广的菌株。
另外,J2、Y2、HJ1、HJ4与H Y2对棉花立枯病菌的抑制率均为100%,其中Y2、HJ1与H Y2对油菜菌核病菌的抑制率也均超过70%,因此可以考虑作为抑制特定病原菌的筛选菌株。
3 结论与讨论
从核桃和黑核桃不同部位分离纯化得到60个菌株,经形态学观察和复侵染接种初步确认为核桃属植物的内生真菌。
60株核桃属内生真菌对5种供试植物病原菌有不同抑制作用的有27株,对4种病原菌有抑制作用的有46株,占总数的76.67%,对3种病原菌有抑制作用的菌株占总数的88%以上,表明核桃属内生真菌具有较广谱的抑菌效果。
60株核桃属植物的内生真菌对5种不同病原菌的抑制效果不尽相同,说明核桃属植物内生真菌的抑菌活性具有一定的选择性。
根据对5种植物病原菌的抑菌活性测定,确定菌株H Y5和J10为广谱型抑制菌,J2、Y2、HJ1、HJ4与H Y2可以用来抑制特定的病原菌。H Y5和J10的其他生物活性及其代谢产物中活性物质的分离纯化有待进一步深入研究。
经初步形态学鉴定,2种核桃属植物中分离得到的60株内生真菌有12株重复,但究竟是同属同种,还是同属不同种的菌株,仍有待进一步研究。
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