备课笔记（讲稿）

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第六章   临床放射生物学研究的主要方法

第一节   细胞存活的测定方法

一、辐射所致细胞死亡的定义

几百戈瑞的大剂量照射之后，所有细胞机能都中止，最终发生细胞溶解，这种情况被认为是细胞即刻死亡或间期死亡；用较低的几个戈瑞照射正在或还能进行的细胞（如骨髓细胞系、皮肤或小肠隐窝），此时部分细胞丧失其或增殖能力。

细胞死亡定义为细胞不可逆的丧失增殖能力，即在下一次或以后的有丝时发生增殖性死亡。因此，子代细胞形态完整而不能发育的受损细胞也许依然能合成蛋白质或DNA，并可能通过一次或几次有丝，然而只要这种细胞失去无限能力则其后代肯定死亡，那么按上述定义都应认为该细胞已死亡。

另一方面，存活细胞或能够生存发育的细胞是指保持细胞增殖能力，并能够因此而形成集落或克隆的细胞，这些细胞称为克隆源性细胞。在体内，肿瘤和正常组织只有一小部分细胞属于克隆源性细胞，受照后期数量迅速减少。上述细胞死亡定义对放射治疗具有特殊意义，因为肿瘤细胞即使全都依然存在，但失去了无限增殖能力，并因此而失去了局部浸润或远地转移的能力，这样也就达到局部控制的目的。同样，对于正常组织，大多数急性和慢性放射效应都发生在丧失生存发育能力的情况下。

因此，必须指出的是在药物离体实验中用得较多的MTT细胞存活测定方法，也曾试图用于检测细胞的放射效应，但终因MTT法反映的细胞“死亡”，不是辐射所致的“细胞增殖性死亡”，从而未能被放射生物学所接受。

二、离体细胞存活实验

1．细胞存活率

以不同剂量照射培养瓶内的群体细胞后，将这些细胞制成单细胞悬液种植到平皿内，或将不同类型的单细胞先种植到平皿内再照射。照射后，根据不同细胞系的生长速度，培养一定时间后可见到下列几种现象：

⑴ 一些细胞依然以单细胞形式存在，不；

⑵ 一些细胞可以完成一次或两次，形成很小的、发育不全的集落（克隆）。这些克隆内的细胞数均达不到50个；

⑶ 一些细胞仍能生长成大集落，尽管这些集落体积大小不一，但与未照射的对照集落没什么差别。这些克隆反映了照射后在平皿内仍能的细胞，即能保留无限增殖能力的存活细胞。计数这些仍保持着无限增殖能力的克隆比例数，就可以算出各个照射剂量点的细胞存活率(survival fraction, SF)。

SF=某一剂量照射实验组的克隆数 /（该组细胞种植数×PE）

PE为未照射细胞克隆形成率，PE =（未照射细胞克隆形成数/细胞种植数）×100%

根据实验细胞的放射敏感性和不同照射剂量，调整所需接种的细胞数。随着照射剂量增高需相应增加接种的细胞数。对于照射剂量的选择，也应根据实验所用细胞系的放射敏感性而异。

2．细胞存活曲线

以剂量为横坐标（线性标度），存活率为纵坐标（对数标度），不同剂量的存活率通过特定的数学模式拟合，可得该细胞系半对数坐标的细胞存活曲线，即细胞剂量效应曲线。该方法建立于20世纪60年代，但在技术和数据处理方法都不断的有所改进，至今仍被认为是反映照射后离体细胞存活情况的最好手段。

细胞群无论是指数生长期还是在相对密度生长期都可以照射。指数生长期细胞是指在培养液内接种少量细胞，它们全都处于增殖状态，其数量成指数性增长。相对密度生长期是指细胞在平皿中没有被稀释再接种，以致细胞密度很高，出现接触抑制，细胞基本停止，进入静止期。

3．离体细胞的乏氧照射技术

在放射生物学研究如何改进放射治疗的效果时，在离体细胞实验中，有氧细胞和乏氧细胞对某一措施的反映性是经常需要观察的内容之一，在放射增敏剂的研究中更是需要。通常用氧增强比(oxygen enhancement ratio,OER)和增敏比(sensitization enhancement ratio,SER)来表示氧和放射增敏剂对放射效应的增强作用。OER是指生命物质在有氧和乏氧状态下得到相同生物效应所需的剂量之比。离体细胞乏氧技术可根据各实验室的条件设计乏氧装置，并测定其OER，一般要求OER值为2.5-3.0，即认为达到乏氧条件。

⑴ 贴壁细胞的乏氧方法：

群体乏氧照射方法：先对群体细胞照射后再分别接种于培养皿内培养克隆。用普通培养群体的25ml细胞培养瓶，从瓶塞插入两根针头，进气的针一般可用去芯的脊椎穿刺针，使针与液面平行，并与液面保持一定距离，针口处于培养瓶的部分斜面向上，使气体不会直接吹动液面。这样可使气体在瓶内液面以上流动，而不会影响细胞的稳定性。针头与橡皮管相接。出气用针可略短。进行乏氧实验时向瓶内通入99.99%或99.999%高纯氮，流量每分钟0.5L，注意不要造成液面的波动。通氮30min后夹紧进、出气针头后橡皮管，阻断通气。进行乏氧状态下照射。

(2) 细胞悬液的乏氧方法：

如图1-6-1-2所示。此装置的特点是可以使进出的气体在细胞表面充分交换。照射时，通过悬液表面流动的氮气来除掉原来空气中的氧气，20ml的悬液细胞置于5cm直径的中性玻璃乏氧瓶内，以每分钟200转进行搅拌，每分钟500ml的流速通30min高纯氮后，即可使细胞处于乏氧状态并进行照射。照射后经出气口取出细胞，按实验设计接种，经培养后测定细胞存活率。

第二节   细胞存活曲线实验过程的质量控制

细胞存活曲线的实验过程一般可分为下列步骤：细胞培养、细胞照射、细胞计数、细胞稀释、细胞接种、克隆计数和数据处理绘图。任何步骤的操作是否正确都会影响最后的实验结果。

三、细胞培养

应使所培养的细胞处于旺盛生长状态，为使细胞处于良好生长状态，应注意细胞培养液的选择、细胞的消化等环节（具体操作同常规细胞培养）。

四、离体培养细胞的照射

保证细胞照射过程的标准化，使实验细胞受到设定剂量的照射，是衡量细胞辐射生物效应科学性和可靠性的基本条件。为保证细胞照射过程的规范化，应注意以下几点：

1．射线种类

据实验目的和要求选择适宜的放射源。对一般实验均选择X射线或γ射线，除非特定实验目的很少采用β射线。

2．细胞照射剂量的设定

根据不同的实验目的，设定能够说明问题的足够照射剂量点。点数太少，影响曲线的拟合及曲线参数的可靠性。剂量点越多，细胞存活曲线的形状就越接近真实情况。在低剂量区各个剂量的间距要小一些，以便更确切地反映曲线的初始形状；在高剂量区则间距可略大些（一般来说，可设置6-8个剂量点，对大多数细胞，以设定0、1、2、3、4、6、8和10Gy等8个剂量点为宜）。主要应根据所用细胞的放射敏感性决定照射剂量的设定。如该细胞系较为抗拒，则特别要注意两点：即低剂量部分的剂量点分布是否已足够将肩区反映出来；另一点是最高剂量点是否够高。应使每条存活曲线的最低存活率至少达到0.01（10-2）范畴或更低，最好达到0.001（10-3）范畴，这样得到的参数才能比较真实地反映某个细胞系的存活情况。否则，用任何数学模式拟合，虽然也可得到一条完整的曲线及得出各种参数值，但有些数据实际是计算机在少数数据的基础上的延伸，而不一定符合真正的实际情况，从而不能反映该细胞真实的剂量-效应关系，影响实验结果的准确性，并由此可能得出错误的、误导性的结论。

3．照射剂量的质量控制

为保证细胞受到设定剂量的照射，必须保证照射条件的标准化。为此在实施细胞照射前，应由放射物理人员根据照射设备、射线性质的特点和具体实验要求，设定相应的照射条件，以保证细胞受到设定实验剂量的照射。照射野不宜太小，如小于5cm×5cm时，应进行实际测量后再行照射，被照细胞不应处于建成效应区内。

五、克隆培养的细胞计数、稀释和接种

1．细胞计数 方法同常规培养。

2．细胞悬液的稀释 方法同常规培养。

3．细胞的接种和培养

⑴ 接种细胞数的计算

进行细胞接种和克隆培养前，应充分了解所用细胞系的生物学特性及克隆形成率，并根据克隆形成率设定所需接种的细胞数。照射以后克隆数减少，为消除不同剂量之间存活率的实验误差，应尽量保持各剂量点培养皿内克隆形成环境相似。即随照射剂量加大而增加细胞种植数，若各剂量组均种植相同的细胞数，则反而加大了实验误差。以细胞存活曲线估算各剂量下应种植的细胞数，其公式为：

应种植细胞数=未经照射的对照组的细胞种植数/该剂量下的细胞存活率

在实际情况下，增加大剂量照射时的种植细胞数，还应避免非单个细胞集落出现之嫌。因此，各剂量组应种植的细胞数需酌情而定，但确定后应在各批实验中维持不变。

一般在一个60mm直径的平皿上，以最多生长100-200个克隆为宜，细胞太多过于密集，会导致克隆数过多而出现相互连接，使计数困难，影响准确性。而照射大剂量时，如所接种细胞数不够，存活细胞太少，克隆数太少，会降低统计的正确性。

⑵ 克隆计数

包括细胞染色和克隆计数两个步骤，注意事项同常规克隆计数法。

⑶ 实验数据的处理

正确处理实验数据的总的原则是：应按放射生物学原理、实验目的及统计学规范选择适宜的数学模型。该模型应能正确反映实验数据的统计学特征；模型中的参数应具有相应的生物学意义。当需要比较两条曲线的数据时，只能在具有同样参数的曲线之间进行比较。因为各种数学模型的参数所反应的意义不同，不能两者混同比较。比较时应选用适合于拟合双方数据的数学模式进行拟合后，再做比较。

4实验的重复性：每批实验一般应重复三次，各次实验的所有步骤及操作均应保持一致。每次实验必须有其本身的对照以及所有的不同条件下的存活曲线，以每一次实验为基础，分别算出存活曲线的各项参数，然后综合三次的结果作出结论。

细胞存活曲线的数学模型拟合方法：

一般采用特定的计算机程序对相应的数学模型进行拟合。有单靶多击数学模型拟合法及线性二次数学模型拟合法。

六、制备同步化细胞群的几种方法

1．收集有丝细胞（Terasima和Tolmach设计）

利用有丝细胞贴附培养瓶表面不紧密的特点。该方法仅限于培养的单层贴壁细胞，这些细胞常常贴附在培养瓶的表面，一旦进入有丝形态逐渐变圆，并且贴附不太结实。若此时轻轻的摇动培养瓶，有丝细胞就脱离瓶壁，悬浮于培养液中，把这些细胞保持在37℃下培养，它们就一起通过有丝时相。这种同步细胞群，通过选择照射时间就可以在细胞周期任何一个时相进行照射。

2．药物法

羟基脲是最常用的药物，适合于离体和在体实验。羟基脲有两个主要作用，一是在S期被结合到细胞内并杀死细胞。另一方面它能阻断细胞进入S期。如使羟基脲和细胞作用的时间等于该细胞G2、M和G1期时间的总和，所有存活细胞就堆积在G1末期这一很窄的阶段。假如此时停止药物的作用，同步细胞群开始重新通过有丝周期。

第二节   实验肿瘤模型及其分析方法

一、实验肿瘤模型的选择  实验肿瘤的类型有：

（1）原发肿瘤；可自发，也可用病毒或化学诱发；

（2）移植性肿瘤；

（3）来自离体培养的肿瘤；

（4）人体肿瘤异体移植瘤。

由强致癌物或病毒等因素诱发的肿瘤，或者不是在同一品系动物身上移植传代的肿瘤往往会出现免疫反应，因此都不能用于肿瘤放射生物学的研究。

二、动物肿瘤和人体肿瘤的可比性  

小鼠肿瘤的绝对体积比人体肿瘤为小，但肿瘤和其载体的整个身体体积的比例，则小鼠要大得多。在放射生物学中，鉴于氧合程度的不同，肿瘤细胞和其附近血管的距离决定该细胞的放射敏感性。在人和啮齿类动物肿瘤内毛细血管和坏死之间的距离是十分相似的。两者间乏氧细胞比例的差距也很小。一般小鼠肿瘤比人体肿瘤长得快。

三、实体瘤接种的部位  

通常实体肿瘤移植部位的选择主要是根据对肿瘤压迫而影响肿瘤血液供应的程度来确定。可以粗略的把接种部位分成三类：一是不受压迫的皮下部位，如胸部、背部和两胁及腹股沟的皮下；二是受压迫的皮下部位，如头、尾和足的皮下；三是体内较深的部位，其中包括肺、肌肉和肾包膜等。除少数特殊肿瘤，如脑肿瘤需选择特定的脑内部位之外，均应根据实体瘤生长特征、实验要求和目的、实验室和照射设备条件等，选择最适宜的接种部位。如所作实验是用肿瘤局部照射的方法，则一般不将肿瘤接种于腋下，因为该处不便于做到真正的局部照射，并且使肿瘤局部乏氧不太方便可靠。

四、实体瘤的接种方法

1．细胞悬液接种（接种105-106个细胞）；

2．组织块移植接种。

五、影响肿瘤对射线反应性的因素  

进行动物辐照实验时，一些因素可以影响实验结果，主要有以下几点，在实验时对下列因素应保证基本一致。

1．肿瘤的大小；

2．接种肿瘤的方法；

3．受体的性别；

4．固定动物的方法；

5．是否应用麻醉剂。

六、实体瘤照射方法

1．一般应该照射肿瘤局部，因为全身照射时肿瘤的反应性和局部照射不一样，而且剂量也上不去。最好是在小鼠清醒状态下照射，以免麻醉对肿瘤反应的干扰。现在已有各种不同形式的固定设备和照射方法，可以让动物不紧张地在清醒状态下接受局部照射。

2．为保证实验结果能如实的反映肿瘤的放射反应性，选择用于照射的肿瘤大小不能差异太大，一般其误差不要大于±0.5mm.。

3．肿瘤的乏氧照射：在放射增敏措施的整体实验中，要观察该措施对肿瘤乏氧的效应时，可用阻断肿瘤局部血流的方法造成肿瘤全部乏氧后照射。可用夹子夹住肿瘤根部的血管或其他能把整个肿瘤血供阻断的手段（如对处于肢体的肿瘤，可将整个肢体的血流在肿瘤的向心方阻断），此时让肿瘤缺血10min，肿瘤内氧就被耗尽，使整个肿瘤处于乏氧状态下受照射。待照射结束后，应尽快恢复血供，以免造成组织坏死或影响肿瘤照射的效应。

七、照射后肿瘤体积的改变  

照射后肿瘤细胞数量的改变与三个参数有关：

1．非活性克隆源性细胞的比例。这种细胞已丧失其无限繁殖的能力；

2．非活性细胞的清除速度；

3．存活的活性细胞的增殖率。

与正常组织一样，大多数肿瘤有所谓的细胞的补充，这是指处于静止状态的细胞进入细胞周期。即使存活细胞的比例很小，只要肿瘤细胞的倍增时间短，就能产生大量的子细胞，当细胞增殖率大于非活性细胞的清除率时肿瘤又开始生长。肿瘤的体积还受一些其他组成的影响：①组织间的液体，即使肿瘤细胞数是恒定的或在逐渐下降，水肿都可以引起肿瘤体积的增加；②非恶性细胞：在有些肿瘤内，非肿瘤细胞（淋巴细胞、巨噬细胞等）的比例是所有细胞数的30%或更多。有些肿瘤受照后，可见到这些细胞的数量有相当程度的增加，从而掩盖了肿瘤细胞数的减少，甚至导致肿瘤体积的增加。因此肿瘤放射后缩小的速度和程度都不能全面地反映放射的效果。肿瘤放射中的消退速度和放射刚结束的即时效果也都不能真正反映放射后的肿瘤生物学行为。从实验研究角度讲，由于观察药物对肿瘤治疗效果最常用的肿瘤抑制率的指标不能客观地反映肿瘤放射后的肿瘤治愈或对肿瘤治疗的效果。因此，就逐渐建立了肿瘤放射生物学特有的系统整体肿瘤实验技术。

八、实体瘤整体内原位分析

1．生长延缓或再生长延缓

是实验肿瘤研究中较实用的观察肿瘤生长特性的指标，经常用以观察实验肿瘤放射治疗效果，评价各种影响肿瘤放射治疗措施或药物的效价。

⑴ 肿瘤生长测定

是最简单最基本的整体实验方法，适用于任何边缘无扩散的实体瘤模型。肿瘤测定常用方法有：①用卡尺测量肿瘤的三维直径（最大径和与之垂直的横径以及厚度），然后以三个值相乘再开立方；②用卡尺测量肿瘤的二维直径（最大径和与之垂直的横径）按椭圆形面积或体积的方法计算肿瘤体积；③位于尾巴上或后肢大腿皮下或大腿肌肉的肿瘤，亦可直接测量其最大直径，作为肿瘤生长的参数。

取各实验组每只小鼠照射后不同时间（天）测得的瘤径，以照射当天为零天，由计算机用特定软件算出该实验各组肿瘤大小和平均生长天数的关系。已达到特定大小的时间（天数）为横坐标，肿瘤大小为纵坐标绘制肿瘤生长曲线（tumor growth curve）。

2再生长延缓和生长延缓指标

① 再生长延缓（regrowth delay）：适于那些受照射后有明显缩小的肿瘤。计算肿瘤在受照射后再生长到照射初时大小所需的时间（天数）。

② 生长延缓（growth delay）：最适于那些受照射后并不明显缩小的肿瘤。是指受照射的肿瘤从接受照射时的大小生长到某一特定大小所需的时间（TX）,并以此与对照组相比较（图1-6-2-2）。

2．50%肿瘤控制剂量（TCD50）实验

TCD50是指50%荷瘤动物的肿瘤得到控制或治愈所需要的照射剂量。实验时将荷瘤动物分成若干实验组，用大剂量照射肿瘤局部，连续定期观察并记录不同剂量照射组小鼠局部肿瘤消退数，然后以照射后不同天数肿瘤局部控制率或治愈率为纵坐标，照射剂量为横坐标作图，可得到不同条件下的剂量效应曲线。

3．核素活性丢失的测试

先将肿瘤内处于活跃增值周期的细胞标上125I UdR。这些细胞死亡和溶解后，将丢失其细胞内与DNA结合的125I UdR。测定肿瘤在受照射后不同时间内核素活性丢失情况，可反映肿瘤受损伤的程度

4．稀释分析技术测定体内肿瘤存活

如图1-6-2-3所示，次方法的操作程序如下：按预定剂量照射荷肿瘤的动物(如10Gy)，然后，以不同数目的细胞接种到一组受体动物的腹腔内，进行观察和初步计算，以测定出需要多少个被照射细胞，使按预定细胞数量接种的动物中有一半发生肿瘤。例如，假定平均有20个照射细胞能传播肿瘤，已知对照组只需2个克隆源性细胞便可传播肿瘤，因此照射细胞群体中有2/20起决定性作用，即10％，这也是10Gy剂量的克隆源性细胞和存活细胞。用这个技术，在各照射剂量下重复这个操作程序，就能测定出所对应的存活率，并绘制出被照射细胞体内检测的存活曲线。

3．用肺集落系统分析肿瘤细胞存活

在荷瘤小鼠原位局部照射后，取出肿瘤并用胰酶消化或机械匀浆制成单细胞悬液，从小鼠尾静脉将一定数量的癌细胞注入受体动物体内，经2－3周后，已可明显地计数肺内克隆时，处死受体动物，将肺用Bouin’s固定。在4倍放大镜下计数各肺叶表面肉眼可见的集落数。肺克隆数反应了注入静脉内混悬液的存活克隆源性细胞数。与对照组相比即可算出细胞的存活率。

第三节    肿瘤的离体模型

在肿瘤放射生物学的离体研究中，通常以离体单层贴壁生长的细胞作为离体实验的模型，这种离体培养的细胞与体内实体肿瘤存在一定的差异，其结果往往不能很好地应用于体内肿瘤。1971年Sutherland首先使用中国仓鼠细胞V79肺细胞培养了具有三维结构的多细胞球体，这种球体在形态学上和生物学上都与动物及人体的实验肿瘤相似。

  成熟的球体从外层到中心有三种不同放射敏感性的细胞群体，它们是：1、非同步的、处于细胞周期的细胞；2、不在周期的G1期样细胞；3、G1期样的乏氧细胞。非常大的球体和许多动物肿瘤相似，可有20％乏氧细胞。可见成熟的球体，犹如体内的肿瘤，其内部的细胞是异质性的。因此可用于观察一些因素对肿瘤的影响。

   球体系统可用于放射增敏剂、化学治疗药物等方面的研究。在人体肿瘤中应用这些药物的主要问题是静止的抗拒细胞常处于远离血管的地方，药物需通过好多层生长活跃的细胞才能到达,从而把药物的有效浓度消耗掉。球体是处于单细胞离体培养和实验动物肿瘤中间的产物，可以模拟许多这类肿瘤的特点，提供一个快速有用而又经济的方法筛选增敏剂和化疗药物。另外多细胞肿瘤球体可作为无血管生长期的早期肿瘤的离体模型。

关于多细胞球体的培养方法在此不作详述，下面仅就多细胞球体生长曲线的测定及多细胞球体的照射后细胞存活曲线的绘制作一介绍。

1．多细胞球体生长曲线的测定

在显微镜下以测微尺测量20－40个球体的直径，取其平均值，以天数为横坐标，平均直径为纵坐标，即获得多细胞球体的生长曲线。多细胞球体的生长曲线和同类肿瘤细胞的单细胞生长曲线相似。生长较慢的肿瘤细胞不适合于球体培养。因它需要较长的培养期，使实验周期延长。当球体长到400μm以上即已有中心坏死区及乏氧细胞，此时可用不锈钢滤网筛选体积相同的球体，作为离体小肿瘤进行

2．多细胞球体的照射后细胞存活曲线的绘制

当大多数球体生长到直径为600μm时，用不锈钢滤网筛选体积相同的球体，将一定数量的球体根据拟照射的剂量组数移入如干个以3％琼脂铺底的培养瓶内。用X射线分不同剂量组进行照射。照射后将球体进行消化，使其成为单个细胞，按不同的照射剂量，分别接种相应的细胞数于培养皿内，在5％CO2及37℃环境中开放培养，根据细胞具体情况1－2周后固定染色，计数克隆生成率，从而获得多细胞球体的存活曲线。

与单细胞存活曲线比较，多细胞球体的存活曲线在低剂量区内（10Gy以下），D0值变大，并随球体体积的增大而增大。从多细胞球体的存活曲线可以清楚地看出乏氧细胞对辐射效应的影响。因此，对于研究作用于乏氧细胞的增敏药物，多细胞球体是一个理想的离体肿瘤模型。下载本文