细胞增殖和侵袭能力的影响

李莉莉范江涛李大海刘炎余佩徽粟燕张文珺

子宫内膜癌是女性生殖系常见的恶性肿瘤，好发于绝

经后妇女。前期临床研究表明，甲壳质酶蛋白40（YKL-40）

在子宫内膜癌患者血清和癌组织中均呈高表达，可作为子

宫内膜癌的候选肿瘤标志物之一[1]。研究表明，YKL-40具

有促进肿瘤细胞增殖、血管形成[2]和抗肿瘤细胞凋亡的作

用，但其具体的生物学功能尚不明。本研究通过小分子干

扰RNA（siRNA）沉默子宫内膜癌细胞系HEC-1A细胞中YKL-40基因的表达，探讨其对HEC-1A细胞增殖和侵袭能力的影响，为进一步探讨YKL-40的生物学功能提供理论基础。

一、材料与方法

1.材料来源：子宫内膜癌细胞系HEC-1A细胞由广西医科大学附属肿瘤医院保存，DMEM/F12培养基购于美国HyClone公司，胎牛血清以及胰酶购于美国Gibco公司，实时荧光定量逆转录（RT）-PCR技术检测试剂盒购自日本TaKaRa公司，四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自美国Sigma公司，穿膜小室（transwell小室）24孔板购于美国Corning公司，人工基底膜基质凝胶（matrigel）购自美国BD公司。YKL-40基因引物由日本TaKaRa公司设计并合成。

2.细胞培养：HEC-1A细胞用DMEM/F12培养基（含10%胎牛血清和1%青霉素、链霉素）置于37℃、5%CO2培养箱中，每日观察细胞生长状态，待细胞融合度达80%时进行传代，取对数生长期细胞进行以下实验。

3.siRNA慢病毒重组载体转染HEC-1A细胞：针对YKL-40的siRNA，由汉恒生物科技（上海）有限公司合成。将HEC-1A细胞分为3组，（1）siRNA组：转染携带针对YKL-40的特异性siRNA的慢病毒，特异性siRNA序列为：GACTCTCTTTCTGTCGGA，转染时选择细胞最佳病毒感染复数（MOI）值为20时进行转染；（2）空载体组：转染只含绿色荧光蛋白（GFP）的空载体病毒；（3）空白对照组：不进行转染。转染成功后用1μg/ml的嘌呤霉素筛选2～3周，耐嘌呤霉素的细胞用于后续实验。

4.实时荧光定量RT-PCR技术检测转染后3组HEC-1A 细胞中YKL-40mRNA的表达：采用TRIzol试剂提取siRNA 组、空载体组、空白对照组细胞RNA，将提取的RNA置于核酸检测仪上测量浓度，实验所需的RNA，其吸光度（A）260/A280比值在1.8～2.0之间，根据实时荧光定量RT-PCR技术检测试剂盒说明书进行稀释和后续操作。RT后cDNA扩增配置20μl反应体系，离心后置实时荧光定量PCR仪进行反应，设置反应条件为：95℃30s；95℃5s，60℃34s，40个循环。YKL-40基因引物序列，上游：5′-ATCACCAAGGAGCCAA ACATC-3′，下游：5′-GGGGAAGTAGGATAGGGGACA-3′。内参照β肌动蛋白（β-actin）引物序列，上游：5′-ACACTGTGCC CATCTACG-3′，下游：5′-TGTCACGCACGATTTCC-3′。根据公式2-ΔΔCt[3]（其中Ct值为循环阈值）计算各组细胞中YKL-40 mRNA的相对表达水平。实验重复3次。

5.MTT比色法检测转染后3组HEC-1A细胞的增殖能力：将3组细胞配制成单细胞悬液，细胞密度为5×104个/ml，以每孔5000个细胞（100μl）接种到96孔板，于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养24、48、72、96、120h，均设计7个复孔。每孔加5mg/ml MTT溶液20μl，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。然后每孔加150μl二甲基亚砜（DMSO），振荡10min，使结晶物充分溶解。置酶标仪上于570nm波长处测定各孔A值，记录结果，以时间为横坐标，A值为纵坐标绘制细胞生长曲线。实验重复3次。

6.体外迁移和侵袭实验检测转染后3组HEC-1A细胞的迁移和侵袭能力：（1）细胞迁移实验：将3组细胞按1×104个/孔接种于transwell小室的上室中，培养24h。transwell小室的下室中加入含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基600μl，上室则为无血清的细胞悬液。5％C02、37℃培养箱中培养24h后，用棉签轻轻拭去小室内细胞，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，4％多聚甲醛固定20min后，用0.1%结晶紫染色30min。PBS冲洗后，置于倒置显微镜下观察、计数细胞并拍照。（2）细胞侵袭实验：将matrigel胶(7∶1稀释)60μl包被在transwell小室的上室，37℃放置过夜。将3组细胞按1×104个/孔接种于transwell小室的上室中，培养48h。transwell小室的下室中加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基600μl，将transwell小室置于5％CO2、37℃培养箱中培养24h。用棉签轻轻拭去小室内细胞和matrigel胶，按上述方法进行固定和染色。随机选择5个高倍视野计数细胞，取平均值。实验重复3次。

7.统计学方法：采用SPSS17.0软件进行统计学处理。实验数据均以xˉ±s表示，3组间数据的比较，采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.转染后3组HEC-1A细胞中YKL-40mRNA表达水平

DOI：10.3760/cma.j.issn.0529-567x.2016.07.013

基金项目：国家自然科学基金（81360388）

作者单位：530021南宁，广西医科大学第一附属医院妇产科通信作者：范江涛，Email：jiangtao_fan1969@163.com

的比较：实时荧光定量RT -PCR 技术检测显示，siRNA 组、空载体组、空白对照组细胞中YKL -40mRNA 表达水平分别为0.31±0.27、1.33±0.62、1.01±0.12，siRNA 组明显低于空载体组和空白对照组（P<0.05）；而空载体组与空白对照组比较，

差异则无统计学意义（P>0.05）。

2.转染后3组HEC -1A 细胞增殖能力的比较：MTT 比色法检测显示，与空载体组和空白对照组比较，siRNA 组细胞的增殖能力明显受到抑制（P<0.05）；而空载体组与空白对照组比较，差异则无统计学意义（P>0.05）。见图1

。

注：siRNA ：小分子干扰RNA ；A 值：吸光度值图1

转染后3组HEC -1A 细胞的生长曲线

3.转染后3组HEC -1A 细胞迁移能力的比较：细胞迁移

实验显示，siRNA 组穿膜细胞数为（133±14）个，明显少于空载体组和空白对照组[分别为（178±11）和（179±19）个，P<0.05]；而空载体组与空白对照组比较，差异则无统计学意义

（P=0.872）。

4.转染后3组HEC -1A 细胞侵袭能力的比较：细胞侵袭

实验显示，siRNA 组穿膜细胞数为（143±13）个，明显少于空载体组和空白对照组[分别为（238±26）和（227±18）个，P<0.05]；而空载体组与空白对照组比较，差异则无统计学意义

（P=0.411）。

三、讨论

子宫内膜癌的发病率逐年增高，严重危害女性的身心健康。子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，常见于绝经后女性，其常见的病理类型为内膜样腺癌，其他还有腺癌伴鳞状上皮分化、浆液性腺癌和透明细胞癌。大量数据表明，子宫内膜癌的发病与许多因素有关，但是具体的病因仍然不清楚。其危险因素有雌激素补充治疗[4]

、肥胖、多囊卵巢综合征等，减轻体质量、长链脂肪酸的服用等可降低子宫内膜癌的发病风险。目前，子宫内膜癌的诊断主要依靠分段诊刮以及手术病理分期，治疗方法主要为手术联合术后放化疗。子宫内膜癌的常见肿瘤标志物

有CA 125[5]、人附睾蛋白4（HE4）[6]

等，YKL -40蛋白也可作为子宫内膜癌的候选肿瘤标志物之一。

1.YKL -40基因在肿瘤中的表达与机制探索：YKL -40基

因最早在1992年被发现，由包括中性粒细胞、巨噬细胞以及肿瘤细胞在内的各种细胞分泌，在多种恶性肿瘤患者的

血清以及肿瘤组织中高表达，如胶质瘤[7]、结肠癌[8]、肺癌[9]等。YKL -40蛋白还高表达于一些炎症性病变组织，被认为是1种炎症因子，如骨关节炎[10]等。在妇科恶性肿瘤如卵巢上皮性癌[11]、子宫颈癌、子宫内膜癌[12]患者的血清以及肿瘤组织中YKL -40蛋白的表达水平也高于正常组织。YKL -40蛋白的表达水平与子宫内膜癌病理分级、手术病理分期、淋巴结转移呈正相关，而与患者年龄、病理类型无关[1]，且YKL -40mRNA 表达水平的高低可作为子宫内膜癌预后的监测指标，子宫内膜癌患者术后YKL -40mRNA 表达水平高者生存时间明显短于YKL -40基因表达水平低者。很多关于YKL -40mRNA 和蛋白的研究表明，子宫内膜癌患者血清以及癌组织中YKL -40mRNA 的表达水平可用以监测其复发和预后。然而，YKL -40基因可促进肿瘤细胞增殖、血管形成、抗肿瘤细胞凋亡的机制尚不明确。研究表明，可能与以下几个信号通路相关：在胶质瘤细胞中，YKL -40基因促进肿瘤细胞增殖可能与细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）通路相关，而信号传导和转录激活因子3（STAT3）通路的活化则与细胞迁移和侵袭相关，基质金属蛋白酶2（MMP -2）蛋白的表达可能与YKL -40基因促进血管形成以及浸润相关；在结肠癌细胞中，YKL -40基因通过炎症因子的释放以及有丝原活化蛋白激酶（MAPK ）通路促进癌细胞的迁移[13]；在卵巢上皮性癌中，通过诱导抗凋亡基因Mcl -1的表达，抑制卵巢癌细胞的凋亡[3]。此外，在1项YKL -40和S100A9基因被敲除的小鼠实验中，YKL -40基因在慢性炎症中通过下调促凋亡蛋白S100A9诱导细胞生存和增殖，并且与STAT3、β连环蛋白（β-catenin ）、核因子κB （NF -κB ）通路有关[14]。YKL -40基因还可通过白细胞介素13（IL -13）受体α2促进巨噬细胞的重塑和修复[15]。

2.YKL -40基因对子宫内膜癌细胞增殖和侵袭的促进

作用：通过siRNA 特异性干扰序列，制备siRNA 慢病毒重组

载体，转染到肿瘤细胞中，可有效抑制特异性基因的表达。本课题组的前期研究已经表明，YKL -40蛋白在子宫内膜癌患者血清和癌组织中呈高表达[12]；而本研究通过siRNA 干扰序列，转染子宫内膜癌HEC -1A 细胞，使YKL -40基因表达下调，然而只转染带有GFP 的慢病毒空载体组细胞则无沉默效应。本研究中，通过MTT 比色法检测显示，转染后siRNA 组细胞的增殖明显受到抑制，且该效应从转染后48h 开始，一直持续到第5天；体外细胞迁移实验和侵袭实验显示，转染后siRNA 组细胞的迁移和侵袭能力明显下降，分别与空载体组和空白对照组比较均有明显差异。表明，YKL -40基因可能在HEC -1A 细胞中发挥促进肿瘤细胞增殖、血管形成、肿瘤细胞迁移和侵袭的作用。有研究显示，通过沉默YKL -40基因的表达使得卵巢上皮性癌细胞系OVCAR3、CA5171细胞的迁移和侵袭能力下降，高表达的YKL -40基因则与肿瘤血管形成相关，表明YKL -40基因可增强卵巢上

皮性癌细胞的浸润和迁移能力[3]。在前列腺癌细胞系LNCaP 、C4-2B 细胞[16]和非小细胞肺癌细胞系CL1-1、CL1-5细胞[17]的研究中，通过特异性siRNA 片段沉默YKL -40基因

总之，本研究从体外细胞实验验证了通过沉默YKL-40基因的表达可以抑制子宫内膜癌的增殖、迁移和侵袭能力，表明，YKL-40基因可能是子宫内膜癌分子治疗的潜在靶点。但是，siRNA干扰细胞增殖的机制尚未明确，需进一步在动物体内实验中获得证据，以明确YKL-40基因与子宫内膜癌发生、发展的关系。

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（收稿日期：2015-11-14）

（本文编辑：姚红萍）下载本文