A ct a V eteri nari a et Zootechnica S i nica

同时检测猪瘟病毒和北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的复合荧光定量RT2PCR方法的建立

成　丹1,3,赵建军1,李　娜1,孙　元1,周艳君1,朱　妍2,田志军1,

涂长春2,童光志1,仇华吉13

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室,哈尔滨150001;

2.军事医学科学院军事兽医研究所,长春130062;

3.农业大学动物医学院,乌鲁木齐830052)

摘　要:应用猪瘟病毒(CSFV)及北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)特异性引物和TaqMan水解探针,建立一种同时检测CSFV和PRRSV的复合荧光定量R T2PCR方法。该方法可检测到3.2TCID50的CSFV和1.8 TCID50的北美洲型PRRSV,比常规PCR方法敏感性高50倍以上。用复合荧光定量R T2PCR方法对155份现地样品进行检测,结果73份为PRRSV阳性,16份为CSFV阳性,13份为CSFV和PRRSV混合感染,与常规RT2 PCR的符合率高达9914%。该复合荧光定量R T2PCR方法敏感、特异、重复性好。

关键词:猪瘟病毒;猪繁殖与呼吸综合征病毒;复合荧光定量R T2PCR

中图分类号:S858128513;S854143　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:0366269(2009)0120072206

Development of a Multiplex R eal2time RT2PCR for Simultaneous Detection of

Classical Swine Fever Virus and North American G enotype

Porcine R eproductive and R espiratory Syndrome Virus

CH EN G Dan1,3,ZHAO Jian2jun1,L I Na1,SUN Yuan1,ZHOU Yan2jun1,ZHU Yan2, TIAN Zhi2jun1,TU Chang2chun2,TON G Guang2zhi1,Q IU Hua2ji13

(1.Di vision of S w i ne I nf ectious Diseases,N ational Key L aboratory of V eteri nary

B iotechnolog y,H arbi n V eteri nary Research I nstit ute,Chi nese A ca dem y of A g ricult ural

S ciences,H arbi n150001,Chi na;2.T he I nstit ute of V eteri nary S ciences,T he

A cadem y of M ilit ary M edical S ciences,Chan gchun130062,Chi na;3.College of

V eteri nary S ciences,X i nj i ang A g ricult ural Universit y,U rum uqi830052,Chi na)

Abstract:A multiplex real2time R T2PCR for simultaneous detection of classical swine fever virus (CSFV)and porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)was developed and evaluated.The detection limit of t he assay was3.2TCID50for CSFV and1.8TCID50for PRRSV.

Out of t he155field samples tested,73were detected po sitive for PRRSV,and16were po sitive for CSFV,and13were shown to be co2infectio ns wit h t he two viruses.The agreement between t he multiplex real2time R T2PCR and conventional R T2PCR was9914%.The met hod was shown to be sensitive,specific,and rep roducible.

K ey w ords:classical swine fever virus;porcine rep roductive and respiratory syndrome virus;mul2 tiplex real2time R T2PCR

收稿日期:2008201217

基金项目:国家973计划(2005CB523202);国家科技支撑计划(2006BAD06A03)资助

作者简介:成　丹(19822),女,硕士生,主要从事猪瘟分子诊断研究

3通讯作者:仇华吉,男,研究员,博士,主要从事分子病毒学与免疫学研究,Tel:0451285935041,E2mail:huajiqiu@hvri.ac.cn　1期成　丹等:同时检测猪瘟病毒和北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的复合荧光定量R T2PCR方法的建立

　　猪瘟(Classical swine fever,CSF)是一种烈性传染病,被世界动物卫生组织(O IE)列入O IE疾病名录(OIE Listed diseases),给世界养猪业造成了极大的经济损失。CSF的病原为猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV),属于黄病毒科(Flaviviri2 dae)瘟病毒属(Pesti vi rus),其基因组为单股正链RNA,含1个大的开放阅读框架(ORF),两侧为高度保守的5′和3′非编码区[1]。

　　猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndro me,PRRS)是20世纪80年代后期出现的、以母猪繁殖障碍和各日龄猪呼吸道疾病为特征的传染病,其病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine rep roductive and respiratory syn2 drome virus,PRRSV)。PRRSV属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属,其基因组为单股正链RNA,含有7个ORF,其中ORF7高度保守[2]。PRRSV分为欧洲型和北美洲型2种基因型,L V株和VR22332株为各自代表株。目前在中国流行的PRRSV几乎都是北美洲型。自2006年起,我国南方暴发的猪“高热综合征”,给我国养猪业造成了巨大的经济损失,据报道,该病的原发性病原为高致病性PRRSV变异株[3]。

　　CSF和PRRS在临床症状和病理变化上不易区分,而且二者有时同时感染猪群。目前用于检测CSFV和PRRSV的方法主要有病毒分离、免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)、免疫荧光试验(IFA)和R T2PCR。但这些方法大都无法同时检测这2种病毒。所以,建立一种同时检测和区分这2种病毒的方法十分必要。

　　近几年发展起来的实时荧光定量R T2PCR (Fluorogenetic quantitative R T2PCR)具有敏感、特异、重复性好、不易污染等优点,已成为检测病原的重要方法。国内外有很多用实时荧光定量R T2PCR 检测CSFV或PRRSV的相关报道[427]。Egli等建立了一种检测不同基因型PRRSV的荧光定量R T2 PCR方法,能检测到1TCID50的病毒,耗时比常规R T2PCR方法缩短1倍[7]。本研究旨在建立能同时检测CSFV和北美洲型PRRSV的复合荧光定量R T2PCR方法。

1　材料与方法

111　病毒

　　猪瘟石门株(Shimen)、PRRSV C H21a株、V R22332株、HuN4株、牛病毒性腹泻病毒I型(BVDV2 1)V ED EVAC株、传染性胃肠炎病毒(T GEV)Hua2 du株、猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777株、猪轮状病毒(PRV)G ottf reid株、伪狂犬病病毒(PrV) Shuangcheng株、猪细小病毒(PPV)Z和猪圆环病毒2型(PCV2)J XL株均由哈尔滨兽医研究所保存并提供。4株不同基因亚群的猪瘟病毒分离株分别为HLJ21(05)(111亚群)、GZ1(98)(211亚群)、Z J2 (99)(212亚群)和HuB2(98)(213亚群)由长春军事兽医研究所提供。

112　荧光定量PCR引物和探针

　　对GenBank中公布的猪瘟病毒Shimen株、Al2 fort株、ALD株、Brescia株等34株CSFV毒株的基因组序列应用MegAlign软件进行比较分析,在其基因组保守的5′非编码区设计了针对猪瘟病毒的通用引物CSFV2F/CSFV2R以及猪瘟野毒株特异性探针CSFV2Probe[5](表1)。

　　检测PRRSV北美洲型毒株的引物和探针,根据Egli等建立的鉴别PRRSV两个基因型的复合荧光定量R T2PCR方法[7],将其在PRRSV高度保守区ORF7片段上设计的通用引物和特异性针对北美洲型毒株设计的探针进行改进,得到PRRSV2F/ PRRSV2R和PRRSV2probe,其序列见表1。

113　病毒RNA的提取和cD NA的合成

　　用TRIzol试剂(Invitrogen公司)或RNeasy Mini RNA提取试剂盒(Q IAgen)参照使用说明书,分别提取全血和病毒培养物或匀浆组织的总RNA,溶于40μL D EPC处理水中,用于合成cDNA。取20μL总RNA(约10μg),加入总体积为30μL的反转录体系中,内含6μL5×反转录Buffer、1μL dN TPs(10mmol・L-1)、1μL92mer随机引物(50 mmol・L-1)、1μL(10U・μL-1)禽源反转录酶(AMV)和015μL(40U・μL-1)RNA酶抑制剂(HPRI),42℃水浴1h,最后70℃15min灭活反转录酶,置-20℃备用。

114　复合荧光定量RT2PCR阳性标准品的制备

　　CSFV标准品为本实验室以前构建的含有CS2 FV5′2NCR的重组质粒,PRRSV标准品为含有PRRSV ORF7的重组质粒。将质粒在紫外分光光度计测定光吸收值(OD260),计算出摩尔浓度,用TE (p H810)连续10×梯度稀释至10拷贝・μL-1,4℃保存备用。

37畜　牧　兽　医　学　报40卷　

表1　复合荧光定量RT2PCR和常规RT2PCR中所用的引物和探针

T able1　The primers and probes used in the multiplex real2time RT2PCR and conventional RT2PCR

引物和探针Primers and probes

引物和探针序列

Sequences of the primers and probes

基因组位置a

Location

扩增产物/bp

Product

CSFV2F CSFV2R

5′2GAACT GGGCTA GCCA T G23′

5′2ACT GTCCT GTACTCA GGAC23′

86-102

183-165

98

CSFV2probe FAM25′2A GG ACT A G CAAACGG A GGG ACT A G CCG23′2T AMARA111-137

PRRSV2F PRRSV2R 5′2TCA GCT GT GCCARA T GCT GG23′(R=A/G)

5′2AAA T GGGGCT TCTCCGGGT T T T23′

14949-14968

15053-15032

105

PRRSV2probe Cy525′2TCCCGGTCCCT T GCCTCT GGA23′2B HQ15015-149995

C1 C2

5′2CCAARA GA GCA T GA GAA GG23′

5′2T TCTCTA TA GT GT T GGTCA T TCC23′

950-968

1749-1727

800

P1 P25′2A T GT T GGA GAAA T GCT T GAC23′

5′2CTAA GGACGACCCCA T T G23′

137-13808

14391-14374

603

a.相对于CSFV石门株(A Y775178)或PRRSV VR22332株(A Y1505)基因组位置而言

a.Corresponding to CSFV Shimen(A Y775178)strain or PRRSV VR22332strain(A Y1505)

115　复合荧光定量RT2PCR条件的优化

　　复合荧光定量R T2PCR用Corbett公司的Ro2 tor Gene3000进行。反应体系为30μL。先分别将检测CSFV和PRRSV病毒的引物和探针浓度进行优化,然后以2个优化好的条件为基础,再用矩阵法对于该复合荧光定量PCR的循环参数、引物和探针的浓度等进行优化,得到最佳反应条件参数(以最低的C T值得到最强的荧光信号)。对反应参数优化后,进行特异性、敏感性和重复性试验。

116　常规RT2PCR

　　用表1所列引物C1/C2进行CSFV的R T2 PCR扩增。PCR用L A T aq DNA聚合酶(Ta KaRa 公司)。在30μL反应体系中,分别加入3μL10×L A Buffer、2μL dN TPs(215mmol・L-1)、引物C1/C2各10p mol、0125μL T aq DNA聚合酶(5 U・μL-1)、2μL反转录产物,用水补至30μL,于梯度PCR仪(Biometra公司)上进行PCR扩增。PCR 程序:94℃预变性5min;94℃变性30s,57℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环;72℃延伸10 min。反应结束后取5μL产物进行电泳鉴定。

　　用表1中的引物P1/P2进行PRRSV的R T2 PCR,PCR反应体系及所使用PCR仪与上面一致,反应条件:94℃预变性5min;94℃变性30s,58℃退火45s,72℃延伸45s,35个循环;72℃延伸10 min。反应结束后取5μL产物进行电泳鉴定。117　现地样品检测

　　对155份全国各地送来的样品应用优化复合荧

光定量R T2PCR和常规R T2PCR进行检测。

2　结　果

211　优化的复合荧光定量RT2PCR的反应条件

　　经过优化后,确定复合荧光定量R T2PCR反应条件:215μL10×Buffer、2μL dN TPs(215 mmol・L-1)、4μL MgCl2(25mmol・L-1)、CSFV2 F(10μmol・L-1)和CSFV2R(10μmol・L-1)各1μL、013μL CSFV2Probe(10μmol・L-1)、PRRSV2 F(10μmol・L-1)和PRRSV2R(10μmol・L-1)各1μL、0125μL PRRSV2Probe(10μmol・L-1)、Hot2 Start EX T aq DNA聚合酶115U,余下用去离子水补足。95℃5min;95℃10s、60℃50s,40个循环。优化的CSFV探针终浓度为011μmol・L-1, PRRSV探针终浓度为0108μmol・L-1,Mg2+终浓度为6mmol・L-1。

212　复合荧光定量RT2PCR的标准曲线

　　通过对荧光定量R T2PCR各条件进行优化后,得出检测CSFV(A和B)和PRRSV(C和D)的扩增曲线和标准曲线(图1)。CSFV荧光定量RT2PCR 标准品的浓度从106～101copies・μL-1具有良好的线性关系(相关系数R2=01997;扩增效率E=019);而PRRSV荧光定量R T2PCR标准品的浓度从106～101copies・μL-1具有良好的线性关系(相关系数R2=019;扩增效率E=1101)。

213　复合荧光定量RT2PCR的特异性

　　对于CSFV、PRRSV、BVDV、T GEV、PEDV、

47

　1期成　丹等:同时检测猪瘟病毒和北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的复合荧光定量R T 2PCR

方法的建立

图1　荧光定量RT 2PCR 检测CSFV (A,B )和PRRSV (C,D)的动力学曲线和标准曲线

Fig 11　The kinetics and stand ard curves of the real 2time RT 2PCR for CSFV (A and B )and PRRSV (C and D)

PRV 、PrV 、PCV2、PPV 感染的细胞培养物和正常细胞对照,分别提取病毒的DNA 或RNA ,反转录后,应用优化好的条件进行复合荧光定量R T 2PCR 检测,结果除CSFV 和PRRSV 外均未检测到荧光信号。　　应用优化好的方法,对不同基因亚群(111、211、212和213基因亚群)的CSFV 和不同毒株(CH 21a 、VR 22332和HuN4株)的PRRSV 进行检测,结果在该检测系统中均有扩增,能够特异性地检出。214　复合荧光定量RT 2PCR 的敏感性

　　将10515TCID 50的CSFV 和10615TCID 50的PRRSV 细胞培养物进行连续10倍梯度稀释,分别

提取RNA 并进行反转录后,运用优化的复合荧光

定量R T 2PCR 方法进行检测,结果表明,CSFV 和PRRSV 的检出限分别为312和118TCID 50。215　复合荧光定量RT 2PCR 的重复性

　　取4份病毒滴度不同的CSFV 和PRRSV ,在

不同的时间分3次提取RNA 反转录后在同一反应条件下分别进行批间重复性试验;批内重复性试验是将提取RNA 反转录后的3份样品每份做3个重复,结果表明,批间和批内变异系数均小于2%,表明该方法具有较好的重复性(表2)。

216　复合荧光定量RT 2PCR 与常规PCR 的符合率

　　用荧光定量R T 2PCR 和常规R T 2PCR 对155

分样品同时进行检测,结果表明,荧光定量R T 2PCR 检测出73分样品为PRRSV 阳性(其中13分同时为CSFV 阳性),16份为CSFV 阳性,而常规R T 2PCR 检测出72份为PRRSV 阳性,15份为CSFV

阳性,2种方法符合率达9914%(表3)。

3　讨　论

311　复合荧光定量RT 2PCR 方法的可行性和必要性

　　抗原检测、病毒分离和常规R T 2PCR 是目前常

用的病毒检测方法,但这些方法大都不适用于早期快速鉴别诊断。Paton 等评价了R T 2PCR 、病毒分离和EL ISA 方法的特异性和敏感性,发现R T 2PCR 敏感性最高[8]。但R T 2PCR 具有耗时长、容易污染、不能定量、敏感性低的缺点。病毒分离被认为是经典的病毒检测方法,但对于病料和细胞要求很高,需要从新鲜的组织、器官和血液中采集病料,并在敏感的细胞中培养,耗时耗力,失败的概率也很高。相比之下,荧光定量R T 2PCR 检测方法具有敏感、特异、高通量、快速、污染概率小等优点,而复合实时荧光定量R T 2PCR 更能对临床症状相似以及早期诊断困难的疫病进行实时定量地鉴别诊断。另外,因

5

7

表2　复合荧光定量RT2PCR的重复性

T able2　The reproducibility of the multiplex real2time RT2PCR

　样品编号

　No.of samples

批内重复Intra2assay批间重复Inter2assay

平均C T值±标准误

Average C T±SD

变异系数/%

CV

平均C T值±标准误

Average C T±SD

变异系数/%

CV

　CSFV 118.4±0.170.918.4±0.33 1.8 222.9±0.190.822.8±0.210.9 327.2±0.150.527.3±0.150.5 430.0±0.150.530.1±0.120.4

　PRRSV 517.3±0.110.517.6±0.20 1.1 621.7±0.180.621.7±0.180.8 725.0±0.070.324.9±0.23 1.0 829.5±0.090.330.0±0.210.7

表3　复合荧光定量RT2PCR与常规RT2PCR的符合率

T able3　Agreement betw een the multiplex real2time RT2PCR and conventional RT2PCR

复合荧光定量R T2PCR Multiplex real2time R T2PCR

常规R T2PCR　Conventional R T2PCR

PRRSV CSFV

阳性Positive阴性Negative阳性Positive阴性Negative

阳性Positive7231151阴性Negative0720139合计Total155155

31其中有13份样品同时为CSFV阳性

3113out of72samples positive for PRRSV were also positive for CSFV

为它能够在一个反应体系中同时检测多种病毒,因此可以节省病料,节省下来的病料可以用于其它研究或验证试验。Persson等建立了一种基于4种荧光标记探针的复合荧光定量R T2PCR检测方法,可以同时检测不同浓度的4种基因[9]。由于CSFV和PRRSV在猪群中往往同时存在,二者引起的疫病(特别是猪瘟和高致病性PRRS)又很难用常规方法区分。因此建立一种能同时检测CSFV和PRRSV 的复合荧光定量R T2PCR方法是可行和必要的。312　复合荧光定量RT2PCR方法的建立和优化

　　本研究在CSFV保守的5′非编码区和PRRSV 北美洲型毒株比较保守的ORF7基因设计特异性引物和不同荧光标记的探针,结合Corbett公司的Rotor Gene3000荧光检测系统,通过对反应条件的优化,建立了一种可以检测和鉴别CSFV和北美洲型PRRSV的复合荧光定量R T2PCR方法。此方法标准曲线的线性范围在106～101,在40个循环内, BVDV、T GEV、PEDV、PRV、PrV、PCV2和PPV 均无非特异性扩增,而不同基因亚群(111、211、212和213基因亚群)的CSFV和不同毒株(C H21a、VR22332和HuN4株)的PRRSV均可被检出;优化条件后,其敏感性大大提高,可检测到初始模板中312TCID50的CSFV和118TCID50的北美洲型PRRSV,比常规R T2PCR方法敏感50倍以上。通过批间和批内重复试验,证明该方法检测的变异系数小于2%,显示出很好的重复性。用复合荧光定量R T2PCR方法对155份现地样品进行了检测,结果在检测的155份样品中,有16份为CSFV阳性, 73份为PRRSV阳性,有13份样品为CSFV和PRRSV混合感染,与常规R T2PCR的符合率为9914%。所有CSFV阳性样品均来自发病猪场;在73份PRRSV阳性样品中,有15份来自健康猪场,占检测阳性总数2015%,有58份来自发病猪场,占检测阳性总数7915%。通过对检测阳性样品进行序列分析,发现CSFV主要为111和211基因亚群, PRRSV基本上为PRRSV变异株(结果未显示),这与我国目前CSFV和PRRSV的流行情况吻合[3,10]。

67　1期成　丹等:同时检测猪瘟病毒和北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的复合荧光定量R T2PCR方法的建立

313　复合荧光定量RT2PCR方法的影响因素和改进措施

　　荧光定量R T2PCR对探针要求非常高,如果探针不够特异,会出现非特异性反应。在复合荧光定量R T2PCR中,由于使用了多种不同荧光标记的探针,可能会出现竞争性抑制作用,从而影响到检测的准确性和敏感性,为了减少这种影响,要合理设计引物和探针,特别是设计探针时,要尽量避开发夹结构,退火温度不能太高或太低,以避免探针与探针以及引物与引物之间的杂交[11212]。研究中发现,探针的浓度对于复合荧光定量R T2PCR的C T值有很大影响,因此探针浓度的优化非常必要。此外,Pers2 son等研究发现,T aq酶的选择至关重要[9],作者发现,Hot Start T aq DNA聚合酶比普通T aq DNA聚合酶理想。当然,该方法还有待完善,虽然其污染概率比常规R T2PCR低,但也可能出现,因此在操作过程中,要规范实验操作,试剂要分装使用,尽量减小污染机会。作者将在现有方法的基础上,继续对其进行完善。

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