摘要：在试验过程中，存在很多的因素会直接影响禽流感血凝抑制试验，从而导致试验结果不正确等现象出现，

禽流感病毒能够与鸡红细胞发生凝集现象，这种红细胞凝集现象可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制实验（HI）。基层工作中常用于新城疫、禽流感等免疫抗体的检测，辅助诊断病毒性疾病等，此方法操作简便、快速、准确、实用，但在实践中也常常由于某些因素的影响，从而使试验结果不精确，有时甚至无法判定结果。

1血凝试验原理和方法

血凝(直接血凝)反应(HA)：利用病毒或病毒的血凝素，能选择性凝集动物红细胞及病毒浓度与红细胞凝集程度呈正相关的特性，采集敏感的动物红细胞配制成1%红细胞悬液与待测定的病毒液在微量血凝板上进行红细胞凝集实验，根据红细胞的凝集程度间接测定病毒中的病毒浓度。方法是用鸡红细胞与标准抗原作用，检测出标准抗原血凝单位,为血凝抑制试验作准备。

2影响血凝试验的主要因素

2.1被检血清变性

被检血清变性严重影响免疫抗体检测。因此，血样采集后要及时分离血清，分离后及时测定或放置在4℃冰箱内保存，要力求新鲜，如暂时不测定可冷冻保存。血清使用前要充分摇匀。

2.2不同来源、不同浓度的红细胞

不同来源、不同浓度的红细胞会使结果差异很大，所以红细胞来源一定要相同。一般需要3只或3只以上公鸡来提供红细胞，将3只以上公鸡红细胞混合在一起。也可由1只公鸡来提供红细胞，但必须经多次试验证明是可行的。有抗体鸡提供的红细胞需要更多次数洗涤。但要注意有时不同的公鸡提供的红细胞对禽流感H5亚型抗体测定，效价差异很大。不同浓度的红细胞对抗体测定也有影响。

2.3病毒悬液和红细胞悬液在使用前没有摇匀

 病毒悬液和红细胞悬液如没有摇匀，加入时浓度高低不一，会人为造成误差。因此抗原和红细胞使用前一定要摇匀，保证每一孔中加入的浓度准确一致。

2.4 4个血凝单位(HAU)抗原配制不准确

4个HAU抗原要现用现配，混悬液要混匀，配好的抗原室温下放置不得超过4个小时，不可反复冻融。为防止4个HAU抗原配制不准确.在作HI试验前必须做4单位抗原校正。用微量移液器向反应板的第二孔至第五孔加生理盐水各25微升，第一孔不加。用微量移液器吸取4单位抗原25微升分别加入第一孔、第二孔中，从第二孔开始挤压4-6次混合，然后吸出25微升至第3孔，依次倍比稀释到第4孔，弃去25微升，第五空为对照空。用微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入1-5孔，每孔25微升。于微量振荡器上振荡1分钟。室温静置20-30分钟后观察结果。若第一、二、三孔为完全凝集，第四孔红细胞为50%沉淀，第五孔为对照完全沉淀，如果出现以上结果，表明所配4单位抗原准确，校正成立。否则，需重新测定抗原效价，重新配制4个HAU抗原，并作4单位抗原校正，直至结果准确。

2.5 适量配制4单位抗原和1﹪红细胞

配制好的4单位抗原在2-8℃保存条件下，3天内效价基本无变化，1﹪红细胞在2-8℃保存条件下，3天内不会发生溶血。超过3天，4单位抗原和1﹪红细胞会因自身效价降低和溶血而影响实验结果。因此，每次实验前要根据待测样品数量计算一下本次实验需要多少的4单位抗原和1﹪红细胞，适当配置，避免因多配而引起浪费。

2.6温度

温度对实验结果也有影响，一般要求在室温25-37℃进行实验，当温度过高，超过37℃以上时，会使反应结果解脱加快，易发生病毒解离，这样，反而阻止反应；当实验温度低于4℃时红细胞有时会发生自凝现象。

2.7微量血凝板的清洁

微量血凝板的清洁度对试验结果有很大的影响。微量血凝板清洁的正确程序为首先用自来水反复冲洗，然后于1%-2%的稀盐酸中浸泡24h以上，再用自来水反复冲洗2-3次，最后经蒸馏水浸泡24h后37℃烘干备用。

3常见结果现象分析

3.1对照孔凝集现象

3.1.1盐类凝集：所谓盐类凝集即稀释液中氯化钠达至一定高浓度时，即使没有血清抗体也能发生凝集反应。

3.1.2当生理盐水被细菌污染时也可出现对照孔凝集。

3.1.3血清变质或受细菌污染时也可以出现对照孔凝集。

3.2.全部凝集

3.2.1 当红细胞受细菌污染或保存时间过长可出现此现象。

3.2.2 抗原滴加时出现失误，工作抗原效价过高。

3.2.3生理盐水受细菌污染或其它因素。

3.3红细胞全部下滑

3.3.1当配制抗原时，配制工作抗原效价过低，不足以凝集鸡红细胞。

3.3.2加样时所有孔全部加成生理盐水亦出现全部下滑现象。

4 HA-HI试验操作中应注意的问题

4.1可根据待检样品的多少和操作者的熟练程度来选定移液器。血凝抑制试验中最常见的是跳孔现象（如第3孔和第5孔均出现血凝抑制，而第4孔却出现凝集），使结果无法判定。微量法的特点是节省抗原，测样多，如用多头移液器可同时检测几个血样，但要求操作者认真熟练，否则会有一定误差。

4.2在微量法中移液工具的准确度直接影响试验结果。若移液使用不当对试验结果有较大影响，应用这种器具前每次都应校准吸液量并将刻度固定好，注意把每个吸头安装牢固密封，操作时手压下的力度均匀，否则移液量偏差，造成结果不准确。

4.2.1移液下压时有二个阻力位置，压下时第一个即为标准刻度的量值，再加力压的第二个阻力位置为放液时用的位置。因此，不要在吸取时将移液重力压入第二个阻力位置，特别是在V型孔中稀释时，有时重压有时轻压,使试验用液吸入不准造成试验结果不准确。现在都使用多头微量移液器代替单道移液器进行实验操作，以提高工作效率，但应用这种器具前每次都应校准吸液量并将刻度固定好。注意把每个吸头安装牢固密封，操作时手压下的力度均匀，否则移液量偏差，造成结果不准确

4.2.2移液在96孔V型板的试验使用中，不要紧靠V孔底部,可能会影响液体正常吸入，造成试验液量偏少。下载本文