碱性蛋白酶是一类最适宜作用PH为碱性的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业性酶类。

从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作，也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。

一 基本原理

⏹自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。

⏹水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。

不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。

⏹碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。

⏹原理：Folin试剂与酚类化合物（Tyr,Trp,Phe）在碱性条件下发生反应形成蓝色化合物，用蛋白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶活大小。

二 实验目的

⏹学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法

⏹学习并掌握细菌菌株的药瓶液体发酵技术

⏹掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法

三  实验器材

1 菌株

从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株

2 溶液和试剂

蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，Na2CO3,Folin试剂，硼砂，酪氨酸，水等

3 仪器和用品

三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸

四 操作步骤

1 培养基和试剂的配制

（1）牛奶平板：在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶

（2）发酵培养基：玉米粉4%，黄豆饼粉3%，Na2HPO4 0.4%,KH2PO4 0.03%,3 mol/l NaOH 调节pH到9.0,0.1MPa 灭菌20min,250ml三角装瓶量为50ml。

（3）PH11硼砂- NaOH缓冲液：硼砂19.08克溶于1000ml水中；NaOH4g，溶于1000ml水中，二液等量混合。

（4）2%酪蛋白：称取2g干酪素，用少量0.5mol/l NaOH润湿后适量加入pH11的硼砂- NaOH缓冲液，加热溶解，定容至100ml，4℃冰箱中保存，使用期不超过一周。

2 酶活标准曲线的制作

  用酪氨酸配制0~100μg/mL的标准溶液，取不同浓度的酪氨酸1mL与5mL 0.4mol/l Na2CO3、1mL Folin试剂混合，40 ℃水浴显色30min，680nm测定吸收值并绘制标准曲线，求出观密度为1是相当的酪氨酸质量（ μg ），及K值。

3 用选择平板分离产蛋白酶产生菌株

  取少量土样混于无菌水中，梯度稀释后涂布到牛奶平板上，37 ℃培养30h左右观察

   建议用地衣芽孢杆菌作为对照菌株

4 产蛋白酶菌株的观察与转接

  对牛奶平板上的总菌数和产蛋白酶的菌数进行记录，选择蛋白水解圈最大的5个菌株进行测量和记录菌落和透明圈得直径，然后转接到肉汤琼脂斜面上，37 ℃培养过夜。

5 用发酵培养基测定蛋白酶菌株的碱性蛋白酶活力

   用初筛获得的5株蛋白酶菌株接种到发酵培养基中，37 ℃、200r/min 摇床培养48h。

6 酶活力的测定

             U=K×A×N×5/10

   K：由标准曲线求出光密度为1是相当的的酪氨酸质量，本实验K=200

   N：稀释倍数

  A：样品OD值与空白对照ＯＤ值之差

　5/10：测定中吸取的滤液是全部滤液的　１/５，而酶反应时间为１０ｍｉｎ

实验报告

１结果记录

２思考题

（１）在选择平板上分离获得蛋白酶产生菌的比例如何？试结合采样地点进行分析。

（２）在选择平板上形成蛋白透明水解圈大小为什么不能作为判断菌株产蛋白酶能力的直接证据？试结合你初筛和复筛的结果分析。下载本文