一、实验题目

蟾蜍坐骨神经干复合动作电位（CAP）

A蟾蜍坐骨神经干CAP阈值和最大幅度的确定

B蟾蜍坐骨神经干CAP传导速度的确定

C蟾蜍坐骨神经干CAP不应期的确定

二、实验目的

确定蟾蜍坐骨神经干复合动作电位（CAP）的

（1）临界值和最大值

（2）传导速度

（3）不应期（相对不应期、绝对不应期）

三、实验原理

神经系统对维持机体稳态起着重要作用，动作电位（AP）是神经系统进行通信联系所采用的信号，多个神经元的轴突集结成束形成神经，APs沿感觉神经有外周传向中枢或沿运动神经由中枢传向外周。坐骨神经干由上百根感觉神经和运动神经组成，分别联系腿部的感受器和效应器（骨骼肌）。如果电刺激一根离体的坐骨神经干，通过细胞外引导方式，就能记录到神经干复合动作电位（CAP）。一个CAP是一系列具有不同兴奋性的神经纤维产生的多个AP的总和。刺激强度越爱，兴奋的神经纤维数目就越多，CAP的幅度也就越大。与胞内引导得到的单细胞AP相比，CAP是双相电位，逐级递增（非全或无），并且幅度较小。

阈电位是指一个刚刚能观测到的CAP，所对应的刺激为阈刺激。在一定范围内增加刺激强度，CAP幅度相应增大。最大CAP所对应的最小刺激电位即最大刺激。

动作电位可以沿神经以一定的速度不衰减地传导，传导速度的快慢基于多种因素，这些因素决定了生物体对其坏境的适应性。它们包括神经的直径、有无髓鞘、温度等等。

神经在一次兴奋过程中，其兴奋性将发生一个周期性的变化，最终恢复正常。兴奋的周期性变化，依次包括绝对不应期、相对不应期等等。绝对不应期内，无论多么强大的刺激都不能引起神经再一次兴奋；相对不应期内，神经兴奋性较低，较大的刺激能够引起兴奋。绝对不应期决定了神经发放冲动（动作电位）的最高频率，保证了动作电位不能叠加（区别于局部电位），以及单向传导（只能有受刺激部位向远端传导，不能返回）的特性。不应期的产生依赖于细胞膜上特定离子通道的特点，如钠、钾离子通道。

四、实验方法

蟾蜍坐骨神经标本的制作

1.双毁髓处死蟾蜍后，剥去皮肤，暴露腰骶丛神经，游离大腿肌肉之间的坐骨神经干及其下行到小腿的两个分支：胫神经和腓神经，三段结扎，剪去无关分支后离体。注意保持神经湿润。

2.  将神经搭于标本盒内，保证神经与电极充分接触，中枢端接触刺激电极S1和S2，外周端接触记录电极R1-R2，之间接触接地电极。

3.  刺激输出线两夹子分别连接标本盒的刺激电极S1和S2，插头接生物信号采集系统RM6240的刺激输出插口；信号输入倒显得红色和绿色夹子分别连接记录电极（绿色夹子在前，引导出正向波形，即出现的第一个波峰向上），黑色夹子连接接地电极，插头接通道1.

A.蟾蜍坐骨神经干复合动作电位（CAP）临界和最大幅度的确定

（1）打开信号采集软件，从“实验”菜单中选取“神经干动作电位”，出现自动设置的界面，各项参数已设置好，界面中只有一个采集通道，对应仪器面板上的通道1（因此信号输入线应连接在通道1）。

（2）确定装置是否正常工作，以及神经是否具有活性。采用较大的刺激强度，1V，刺激时程0.2ms，延时5ms，刺激模式为但刺激。选择“同步触发”，按下“开始刺激”后，正常情况下屏幕上会出现一个双相电位即CAP。

（3）快速降低刺激强度，确定CAP的阈电位。记录刺激阈值及CAP幅度（波峰与波谷之间的差值）。

（4）以0.05V或更小的间隔，逐渐增大刺激强度，观察CAP幅度的变化，同时，记录刺激电位及对应的CAP幅度，直到CAP达到稳定，即最大值（神经标本在正常生理活性时，1V以内的刺激强度即可引起最大的CAP）。

B.蟾蜍坐骨神经干复合动作电位（CAP）传导速度的确定

（1）从“实验”菜单中选取“动作电位传导速度”，界面出现两个采集通道，对应通道1和通道2，因此采用两对引导电极R1-R2和R3-R4，同时输入两道信号。

（2）使用单刺激模式，调整刺激强度，使产生最大CAP。

（3）测量两个通道显示的动作电位起点的时间差。

（4）测量R1和R3之间神经的长度。

（5）重复步骤1-4至少三次。

（6）计算传导速度：传导速度=△D（mm）/△T（ms）

（7）计算几次重复测量得到的传导速度的平均值（Mean）和标准误（SEM）。

C.蟾蜍坐骨神经干复合动作电位（CAP）不应期的确定

（1）采用双刺激模式，刺激条件相同，产生一对幅度相同的最大的CAP。

（2）逐渐减小两刺激间隔，直到第二个CAP幅度刚刚开始减小，即进入相对不应期。此波间隔与绝对不应期之差即为相对不应期。

（3）继续减小间隔，直到第二个CAP刚刚完全消失，此间隔即为绝对不应期。

（4）重复步骤1-3至少三次。

（5）计算绝对不应期和相对不应期的均值（Mean）及标准误（SEM）。

五、实验结果

A蟾蜍坐骨神经干CAP阈值和最大幅度的确定

图1. 蟾蜍坐骨神经干CAP的阈电位（当前刺激强度为0.16V）

图2. 蟾蜍坐骨神经干CAP的最大幅度2.28mV（当前刺激强度为0.70V）

表1.蟾蜍坐骨神经干CAP随刺激强度的变化数据

图3 蟾蜍坐骨神经干CAP随刺激强度的变化曲线图

由以上图表可知，当刺激强度为0.16V时，刚好能观察到一个CAP；之后随着刺激强度增大，动作电位的幅度也就越来越大；当刺激强度达到0.70V时，CAP达到最大，为2.280mV；继续增大刺激强度，动作电位的幅度就不会增大了，而是略微降低。由此可得在一定范围内，坐骨神经干复合动作电位的幅度随着刺激强度增大而增大。但当刺激强度超过一定范围后，坐骨神经干复合动作电位就不再增大了。

神经干是混合纤维，包含着多种兴奋性不同的神经。阈强度的刺激刚刚可以引起其中一些兴奋性较高的纤维产生动作电位，随着刺激强度的增加，其余兴奋性较低的纤维陆续产生动作电位。当刺激超过顶强度时，全部神经纤维产生动作电位。所以神经干的动作电位会随着刺激的增大而增大，直到产生最大动作电位。  

B蟾蜍坐骨神经干CAP传导速度的确定

图4. 某次神经干兴奋传导速度的测定图

表2. 蟾蜍坐骨神经干传导时间记录数据

C蟾蜍坐骨神经干CAP不应期的确定

图5.双刺激下刚刚进入相对不应期内的神经干CAP图

图6. 双刺激下刚刚进入绝对不应期内的神经干CAP图

表3.蟾蜍坐骨神经干相对不应期和绝对不应期的测量数据

三、分析与讨论

1、对比动作电位，分析神经干复合动作电位（CAP）的特点，并解释其随刺激幅度变化而变化的现象。

神经干动作电位振幅随刺激电压增加而增高,不具有“全或无”性质。神经干动作电位是由许多这种兴奋性不同的单根神经纤维的动作电位综合成的复合性电位变化。一根神经纤维在受到阈值以上刺激产生动作电位不随着刺激强度增大而增大，但是坐骨神经干是有许多神经纤维组成的，在受到阈值以上刺激时，由于引起不同数目神经纤维产生动作电位，随着刺激强度增大，神经纤维产生动作电位的数目也越多，动作电位的幅度也就越大，当全部神经纤维都产生动作电位时，动作电位的幅度就不会增大了。故在一定范围内，坐骨神经干动作电位的幅度随着刺激强度增大而增大。

2、分析解释测量神经传导速度的实验中通道2和1所记录的CAP的不同之处；分析蟾蜍坐骨神经干中所包含的神经纤维种类及其传导速度，判断所测定的纤维类型，分析实验中可影响传导速度数值的因素。

（1）通道2记录的CAP的幅度小于通道1记录的CAP幅度。坐骨神经中枢端的神经纤维多，越向外周端神经纤维越少，而通道2电极位于外周端，通道1电极位于中枢端。所以通道2处发生兴奋的神经纤维比通道1兴奋的神经纤维少，所以幅度比通道1小。

（2）不同类型的神经纤维传导速度不同，其传导速度主要受神经纤维的直径、内阻及有无髓鞘的影响。蛙类的坐骨神经干属于混合性神经，其中包含有粗细不等的各种纤维，其直径一般为3-29μm，其中直径最粗的有髓纤维为Aα类纤维，它是蛙神经的主要组成部分，传导速度在正常室温下为35-40m/s。蟾蜍的坐骨神经是混合神经，由实验测得神经纤维的传导速度是24.335m/s，可知其神经纤维主要类型是A类神经纤维。

（3）实验中可影响传导速度数值的因素：

a)分离坐骨神经时不小心使用了铁质的解剖针、镊子等，而不是玻璃分针，导致分离出来的神经的活性不是很好，受到了损伤；

b)离体的神经暴露在空气中很容易干燥，生物活性受到影响；

c)神经由于受到连续刺激，活性下降。

d)实验中神经是否剥离干净以及完整会影响其兴奋传导速度

e)环境温度等也会影响神经活性，从而影响其兴奋传导速度。

3、分析不应期之内 CAP变化的原因；

 不应期可分为绝对不应期和相对不应期，在绝对不应期内，无论给以多大的刺激，CAP都不会改变，而在相对不应期内， CAP仍然会改变，只是所需的刺激强度更大。

 绝对不应期产生的原因：钠通道激活后必须首先进入失活状态，然后才逐渐由失活状态恢复到关闭状态，以备下一次激活。它不能由激活状态直接进人关闭状态。动作电位产生过程中是由钠通道激活导致钠离子内流，所以第一次兴奋后，钠通道由激活状态进人失活状态后，这时无论给予其多么强大的刺激，均不能引起其再次开放，即引起新的动作电位。

 相对不应期产生的原因：在绝对不应期之后， Na离子通道部分开放，Na离子内流，细胞的兴奋性逐渐恢复，但仍低于原水平，受刺激后可发生兴奋，但刺激强度必须大于原来的阈强度。而且由于通道活性未达到正常水平，所以第二个动作电位幅度小于会正常值。

4、分析电生理实验中细胞外记录和细胞内记录在方法学、所获信号以及应用方面的不同之处。

细胞外记录是指不用刺入细胞，只放在细胞表面或附近组织即可记录的技术；细胞内记录则是要刺入细胞内部进行记录。由于电极不刺入细胞，细胞外记录不会对细胞造成伤害，对于非常小的细胞以及血压、呼吸活动引起震动较大的在体情况下，难以用细胞内记录时使用细胞外记录是非常实用的。而细胞内记录对仪器要求更加精准，可准确测定膜电位以及记录突触等微观结构的活动。所以细胞外记录主要利用可兴奋组织如神经、肌肉等的生物点现象，观察组织细胞的正常功能、病理及药物变化，如脑电图等就是细胞外记录的重要应用。而细胞内记录是生理学发展到细胞水平后，研究神经、肌肉等细胞基本生物特性的有利手段，如利用微电极技术将电极插入细胞膜内，用于测量膜电位、EPSP 、IPSP等。

5、分析实验中出现和应该注意的问题

（1）分离坐骨神经时，避免过度牵拉神经，且需将周围的结缔组织去除干净。

（2）用棉线结扎神经时，棉线不要留的太长，以免干扰信号；

（3）分离后的神经和肌肉要随时保持湿润，避免用手或镊子触碰神经，肌肉如果太干    燥，又在强烈电刺激下， 很可能痉挛，这样不仅损伤了神经和肌肉，也导致实验很难进行下去。

（4）实验过程中要经常用任氏液湿润标本，每次刺激后应使肌肉休息一段时间，防止连续刺激损伤其活性。

（5）标本盒两电极之间不要残留液体，防止电极间短路。

（6）测量神经干传导速度时神经干要尽可能长，两个引导电极之间的距离尽可能远，这样得到的实验数据更为准确。

（7）神经要伸直放置，且确保其接触各个电极。另外，测量神经传导速度时，要确保神经与电极垂直，不然会影响实验结果。

六、参考文献

生理学实验（第三版），解井田 赵静， 高等教育出版社，2009 

人体及动物生理学（第三版）王玢 左明雪，高等教育出版社，2009 

人体解剖学及动物生理学实验讲义，生理学实验教学团队，2015年3月下载本文