3
邹春静
1,233
盛晓峰1 韩文卿1 徐文铎
2
(1上海交通大学生命科学技术学院,上海200030;2
中国科学院沈阳应用生态研究所,沈阳110016)
摘 要 同工酶几乎存在于所有生物的所有组织中,是生物化学和分子生态学的重要研究内
容。本文阐明了同工酶分析技术的特点,及其在植物系统学、植物生理生态学研究中的应用,并着重阐述了同工酶分析技术在云杉研究中的应用。关键词 同工酶,染色法,植物系统学,植物生理生态学,云杉
中图分类号 Q945 文献标识码 A 文章编号 1000-40(2003)06-0063-07
Isozyme analysis technology and its application in plant research.ZOU Chunjing 1,2,SHEN G Xi 2aofeng 1,HAN Wenqing 1,XU Wenduo 2(1College of L if e Science and Biotechnology ,S hanghai Jiao Tong U niversity ,S hanghai 200030,China ;2Institute of A pplied Ecology ,Chinese Academy of Sciences ,S henyang 110016,China ).Chinese Journal of Ecology ,2003,22(6):63～69.
Isozyme exists almost in all individuals and all organisms.It is the important research field of bio 2chemistry and molecular ecology.This paper described the characteristics of isozyme analysis technol 2ogy ,and its application in research on plant systematics and plant physiologyical ecology ,and espe 2cially in research on s pruce.
K ey w ords isozyme ,dye method ,plant systematics ,plant physiological ecology ,spruce.
3国家自然科学基金资助项目(39900019,30070129),中国博士后科学基金资助项目。33通讯作者
收稿日期:2003-05-06 改回日期:2003-06-19
1 引 言
同工酶是指催化反应相同而结构及理化性质不
同的一组酶,它们几乎存在于所有生物中[2,39]。同工酶作为一类蛋白质,广泛存在于生物的同一种属,同一个体的不同组织,同一组织或同一细胞中[17]。根据同工酶来源和结构的不同,从遗传学的角度可将它分为4类:①单基因决定的同工酶;②多基因决定的同工酶;③复等位基因决定的同工酶;④修饰同工酶或次生同工酶。在生物进化过程中,同工酶是为了适应细胞代谢的多方面需求而产生的,其功能在生理上表现为对代谢的调节作用[44]。在遗传上,当一种酶同时受几个基因控制时,更容易适应环境的变化,一个基因由于突变而无用时,其它基因的存在仍然可以产生类似作用的同工酶,这有助于机体减小基因突变造成不利后果的影响[10,36]。迄今为止,被详细研究的同工酶已有几百种,具体运用于植物、动物、微生物、农业及医学等方面,其中已确定的
植物同工酶有α2淀粉酶、β2淀粉酶、酸性磷酸酶、乙
醇脱氢酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、儿茶酚氧化酶、肽链内切酶、酯酶、谷氨酸脱氢酶、天门冬氨酸氨基转移酶、肽酶、苹果酸脱氢酶、氨肽酶等[36,39]。研究最多的是过氧化物酶、酯酶和过氧化氢酶[61]。随着
现代生物技术和分子生物学的发展,对同工酶的研
究也日益成为细胞分化和形态遗传学的分子学基础中的重要内容[51,58]。同工酶分析技术是通过电泳和组织化学方法进行特异性染色而把酶蛋白分子分离,并将其位置和活性直接在染色区带以酶谱的形式标记出来。该技术逐渐成为分子水平上研究生命现象的一种重要手段[43]。随着同工酶分离技术的不断发展和完善,其应用必将更加广泛。2 同工酶分析技术211 同工酶分离方法
同工酶分离方法主要有电泳法、层析法、酶学法和免疫学法等,其中以电泳法应用最为广泛。其原理在于同工酶是功能相同但结构不同的一组酶,由于其结构中氨基酸序列或组成有差异,致使同工酶在电泳时,其迁移率也存在差异[7]。212 同工酶分离的常用电泳技术21211 淀粉凝胶电泳法 这是最古老的电泳方法之一,其优点在于便宜,无化学毒性物质,可以迅速筛分不同活性的酶,但其分辨率不高。
生态学杂志Chinese Journal of Ecology 2003,22(6):63～69
21213 等电聚焦 利用同工酶的等电点不同,在电泳支持物中加入两性电解质载体,因电场的作用,同工酶在PH梯度凝胶中泳动,当迁移至其等电点的PH处,则不再泳动,而浓缩成狭窄的区带。这种方法分辨率很高,但该法得到的同工酶常失活[11]。21214 双向电泳 利用蛋白质或酶样品中不同组分等电点的差异,进行第一向分离;然后纵向切割以垂直于第一向的方向进行第二向电泳,从而使不同分子量的蛋白质或酶样品进一步分离[59]。本法分辨率高于各种单向电泳,但同工酶易失活,特别是碱性同工酶的分析,应采用其它技术方法。
213 同工酶位点及酶系统的选择
同工酶是基因表达的产物。通过适当的酶系统可以准确识别染色体上的基因位点,从而在最接近DNA的水平上来研究植物群体的变异[47]。同工酶电泳方法克服了传统分析方法所固有的弱点,排除了环境的干扰,使不同的物种及不同的研究可在同一水平上进行比较。由于分析的物种,所用的材料不同,分析及所利用的酶系统也存在差别。因此,初次研究某一树种时,筛选并确定适宜的等位酶系统及位点是非常重要的基础工作。
张含国等[9]以红皮云杉(Picea koraiensis)种子的胚乳为材料,通过对多种等位酶系统提取、电泳及染色方法的比较,得出了最佳的提取液和各种同工酶最佳的凝胶缓冲系统,各种云杉不同酶的控制位点,筛选出适于红皮云杉遗传研究的等位酶分析方法,为红皮云杉遗传多样性研究奠定了基础。
214 同工酶的染色方法
染色技术即同工酶的染色方法有原染色法、荧光染色法、放射染色法、电子传递染色法和酶连锁染色法等,后三种较为常用,其中以电子传递染色法最常用[1]。染色的原理是利用酶活性的特异性,在染色液中加入底物和酶活性所需的因子,通过酶促反应生成有色物,显示酶带,以便观察和记录结果。
王秀芬[1]曾经对过氧化物酶同工酶的染色方法进行过对比研究,并从醋酸2联苯胺染色液、抗坏血酸2联苯胺染色液或联大茴香胺染色液进行染色的多种材料的过氧化物酶染色结果,发现以醋酸2联苯胺染色液为最佳,因为其对酶带着色灵敏度高,染色浓,染色时间短,节省时间,毒性也很小。
在同工酶染色新方法研究上也有很多成果。在赵赣等[31,32]的研究中发现利用KMnO4可与萘酚反应生成有色物质的性质可对脂酶同工酶进行染色,虽然此方法得到的结果颜色较淡,但是可以用便宜的KMnO4代替昂贵的坚牢蓝RR。在过氧化物同工酶染色方面,赵赣等[32]将电泳凝胶放在H2O2中浸泡一段时间后,过氧化菌催化H2O2生成H2O 和O2,在没有过氧化菌的地方,H2O2在中性条件下与KMnO4反应,可以在棕色背景下看到透明条带。215 常用分析的同工酶
尽管可用来分析的同工酶有百余种,但过氧化物酶和脂酶是两种最常被用来分析的同工酶。过氧化物酶在植物组织中广泛分布,参与多种生理活动,并且为生长发育提供了基因表达的灵敏指标,是一种重要的遗传标记[6,60]。脂酶则与植物体内各种酶类的水解息息相关[30]。
216 酶谱分析
根据迁移率R f值绘制同工酶酶谱及聚类分析;
①计算酶谱的相似性系数:c=2w/(a+b),其中, a为种A酶谱的酶带数,b为种B酶谱的酶带数。w 为A,B两种的相同酶带数,②计算不相似性系数值:d=l-c。③采用未加权配群法,即U PGM A 法,进行聚类分析,根据结果绘出树系图。④计算Xi 值:Xi=(L+Da-Db)/2L。把不相似值总计最大的种酶谱定为a,在X轴上标记为0,Xi为所求种酶沿x轴对种A酶谱的距离;L为种A的a与B的b之间的不相似值,Da为种A的a与所求种酶之间的不相似值;Db为种B的b与所求种酶之间的不相似值。经过计算得到各酶谱在X坐标轴上的排序,通过在轴上距离的远近,可以来推测各分类群之间的亲缘关系[41,45]。
3 同工酶分析技术的应用
311 在植物系统学研究中的应用
在植物系统学研究中已经广泛的应用同工酶分析技术研究植物间的亲缘关系,并获得了较为准确的结果[4,57]。张淑改等[11]用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对松科四种植物脂酶同工酶分析,并以酶距作为种属间酶谱分析的数量化指标,采用排序法对其亲缘关系进行比较分析。结果表明;同一器官在不同
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生态学杂志 第22卷 第6期 种间及同一种内不同组织器官间脂酶同工酶谱差异明显,华北落叶松(L arix principis2rupprechtii)与油松(Pinus tabulaef ormis)、白皮松(Pinus bungeana)、华山松(Pinus armandi)的亲缘关系较远,华山松、白皮松、油松三者间亲缘关系较近,其中以华山松与白皮松亲缘关系最近。Brewbaker[48]分析了玉米(Zea mays)的叶、茎、鞘、花、种子等不同器官和组织的过氧化物酶同工酶。结果显示各组织的酶谱差异很大,而大多数组织有其专一的同工酶带,说明在高等植物的生长发育过程中,同工酶的多种分子形式具有阶段特异性和组织特异性。由不同组织和器官的生理功能和代谢类型的不同所导致的同工酶的器官特异性或组织特异性,叫做组织多型现象。有人证明普通小麦的过氧化物酶的活性与株高呈高度负相关。有人对水稻(O ryz a sativa)、高粱、小麦(T riticum ses2 tiv um)和长穗堰麦草(Sorghum V ul gare)等四种植物不同发芽期的过氧化物同工酶的分析。结果表明,在种子萌动以前,它们的过氧化物酶同工酶很少,待幼芽长到015～1cm以后,它们的过氧化物酶才得到充分的表达[24]。这说明植物过氧化物酶同工酶的多寡和有无,与植物不同发育时期,与植物的不同组织、器官的分化形成及特定的生理状态等均有密切关系。潘鼎元等[40]采用聚丙稀酰胺凝胶电泳法,对甘草属长荚果系的8种及变种的亲缘关系进行研究,根据各酶谱面积的百分率可把甘草属长荚果系分为2类:一类有石河子甘草(Glyy rrhiz a shiheziensis),膜荚甘草(G1korshi n2 skyi),乌拉甘草(G1uralensis),无腺毛甘草(G 1eglandulosa),光果甘草(G1glabra),这类甘草的遗传距离较短,亲缘关系最为密切。另一类有黄甘草(G1eurycarpa),长果甘草(G1i nf laf a),密腺甘草(G1glabra var1glandulosa),阿拉尔甘草(G1 alalensis),这类甘草与一类甘草遗传间距离较大。
广泛存在于植物体内的过氧化物酶同工酶是植物体适应环境变化并对变化了的环境做出灵敏反应的一类酶,常被认为是植物对逆境环境抗逆作用大小的标志。研究污染区树木体内过氧化物酶同工酶的变化,是探索树木抗污染性质的有效途径之一。何士敏等[6]通过研究大庆石油化工污染区及非污染区的树木叶片内的过氧化物酶同工酶的酶谱、酶含量及酶活性间的差异,发现大庆石化污染区植物过氧化物酶同工酶含量增高,酶带增多,酶活性增强,标志着保护反应增强,即抗石化空气污染的能力增强。增多的同工酶可能是植物体在逆境中新合成的逆境蛋白。根据同工酶分析结果和各树种在污染区及对照区的生长情况,过氧化物酶同工酶的3项生化指标变化幅度小的抗石化空气污染的能力强,变化幅度大的抗污能力弱。6种树木对石化空气污染的抗性强弱依次为云杉、旱垂柳(S ali x m atsu2 dana)、中东杨(Popul us beroli nensis)、白榆槭、丁香(S y ri nga oblata)、白蜡树(Fraxi nus americana),为科学选择抗石化污染树种提供科学依据[6]。
诸葛菜(O rychophragm us violaceus)是一种珍贵的资源植物,不同种源的株形、植物体的被毛状况、叶和花的大小、农艺性状、叶绿素、元素含量、生育期、抗病性等差异明显。李军[14]研究了5个地理环境生长的诸葛菜过氧化物酶的同工酶谱,并发现其谱带强弱和电泳迁移率差别极大。酶带数最多的为北京及北碚诸葛菜,各9和10条,贵州、成都、杭州诸葛菜最少,分别为6,7,7条带。酶带图谱呈现A,B,C3个区级。各地区相应区段中的酶带数及其Rf值各不相同。虽然5个地区的诸葛菜酶谱存在明显差异,但基本谱带(主带)Rf0143和0116位置、着色程度和宽度比较一致。这表明各地生长的诸葛菜存在着大同小异的基因,其过氧化物酶同工酶所含蛋白质分子,亦存在不同大小级别的差异。过氧化物酶同工酶不但反映了诸葛菜地理种源间的遗传差异,而且还显示了与形态差异的对应。说明不同地理种源的诸葛菜POD酶谱差异,是内部条件造成的,同工酶是基因座的直接产物,其表现的遗传结构主要受基因漂变和基因流及繁衍系统所影响。当诸葛菜内部环境发生生理过程时,个体的表现型差异明显[14]。POD酶谱差异,还可能是由于起源不同,造成了过氧化物酶同工酶谱多样性。这一研究为不同地理种源的植物的比较研究开辟了一条新途径,为植物生态型分化研究提供了颇有价值的参考。
我国大兴安岭有3种五针松,即偃松(Pi nus pum ila),西伯利亚红松(P1sibi rica)和兴安松(P1 hi ngganensis),但对兴安松的分类一直存在争议,有人认为是偃松的直立类型,也有人认为它是偃松与西伯利亚红松的杂交种,还有人认为它是偃松的返祖现象。陈凤英等[23]通过过氧化物酶同工酶谱的研究,结果表明偃松与西伯利亚红松都有种的特征酶谱,其酶谱距离为01600;兴安松针叶酶谱与偃松距离为01368,但它们的根部的POD同工酶及同工酶谱极其相似,说明它们之间的亲缘关系很近。
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邹春静等:同工酶分析技术及其在植物研究中的应用陆静梅等[22]对红松(Pi nus koraiensis)与前红松(Pi nus prokoraiensis)两种同工酶进行了比较研究。结果表明;红松与前红松针叶中的过氧化物酶和超氧化物歧化酶同工酶谱存在明显差异,红松具两条酶带,前红松仅有一条,酶带着色深浅与宽窄也不同,反应了物种间的亲缘关系。红松的POD同工酶活性高于前红松5倍,SOD同工酶活性也比前红松略高。从分子水平上验证了红松和前红松作为两个种的准确性,表现出前红松比红松原始的结构特征与生理特征的一致性[22]。
杨一平[20]利用酯酶(EST)同功酶研究了长白山天然红松林遗传变异,在天然红松林4个取样中发现12个酯酶同功酶谱,并在酶谱还发现了三个基因位点:酯酶A(EST2A),酯酶B(EST2B)和酯酶C (EST2C),而在这些位点中有2个位点是多态的, EST2A位点有6个不同等位基因,它们的表型是以一个带,两个带或几个带表示的。EST2B位点是具有等距两条带不同迁移率的3个等位基因,因此认为红松天然林的结构是多态型群体。
312 在植物生理生态学上的应用
由于同工酶参与植物的大多数生理生态活动和代谢途径,因而同工酶分析技术在植物生理生态学研究中应用相当广泛[49]。在植物的不同发育阶段和不同器官组织中同工酶都具有特异性表现,其合成受一系列基因的,常作为遗传信息的指标来研究植物的生长发育和器官分化[15,50]。从植物种子生活力、组织与器官分化、生长及胚胎发育,以及环境因素和植物激素都会影响到同工酶的变化。植物在不同发育时期其同工酶酶谱也有差异[53]。有人比较分析了水稻不同发育时期淀粉酶、酯酶同工酶的变化,结果显示,随着发育进行,酶谱带数目增多,达到一定生育时期后则趋于稳定。罗立新等[26]对杜仲(Eucom mia ul moi des)枝条中多糖贮量和淀粉酶,过氧化物酶的变化与形成层关系进行了研究。崔克鸣等[38]研究了白皮松在环割后新生微管组织中过氧化物酶、酯酶的变化。环境条件的变化时常导致同工酶谱的改变。从石竹培养中测出过氧化物酶、酯酶、酸性磷酸酶的同工酶都受到光及温度条件的影响。在烟草中光和温度可以影响苹果酸脱氢酶的酶谱。陈一舞等[24]对大豆在盐胁迫下超氧化物歧化酶的变化进行了研究。杨一平[18]对红松群体内和群体间的同工酶变异进行了研究。这些都说明同工酶对环境反应很灵敏。各种植物激素也可导致同工酶变化。Lee的一系列研究工作指出烟草愈伤组织的过氧化物酶谱受到外源植物激素在量上及质上的。高浓度的IAA引起两个新的过氧化物酶同工酶出现,在有IAA时,赤霉素及玉米素也能诱导新的酶带。靳月华等[33]研究东北地区柳树分布与SOD同工酶谱带的变化关系,三种不同生境下的6种柳树叶片SOD同工酶谱带的Rf值分别为0139和0145。其中龙爪柳(S ali x m atsudana var. tort uosa)、垂柳(S.babylonica),这两条谱带十分明显。粉枝柳(S.rori d)、蒿柳(S.vi m i nalis)除这两条谱带外,还出现了一些小波峰,及一条迁移较大的谱带,而生长在长白山高山苔原带的园叶柳(S.ro2 t undif olia)和长园叶柳(S.metaf ormosa)除两条谱带为柳属共有之外,分别又出现7条和5条新的同工酶谱带,这正是适应高山恶劣生态条件的生理调节功能和遗传基础,也说明了SOD是一个诱导适应酶。长白松(Pi nus sylvest rif orm is)是长白山特有的珍稀濒危植物。自然分布范围较狭,主要分布在长白山北坡海拔650～1600m,形成2个自然群体,一个是在海拔690m胡枝子2长白松林;另一个是在海拔1150m左右的越桔2长白松林[34]。杨一平等采用聚丙稀酰胺凝胶电泳技术,检测了长白松雌配子体的谷氨酸草酰乙酸转氨酶(G D T)苹果酸脱氢酶(MD T),酸性磷酸酶(ACP),谷氨酸脱氢酶(G DH),和葡萄糖脱氢酶(G L UDH)的同功酶型,根据多态基因位点标准,发现检测基因位点的63%是多态的。8个基因位点所有样品的杂合性的平均值是013157。每个基因位点的平均等位基因数是2119。两个自然群体间的同功酶多样性分化,对8个基因位点的基因多样性测量表明,群体间基因多样性的分化明显,效果是9%,总基因多样性的91%在群体内,两个群体间的遗传距离是010619[19]。羊草(L ey m us chi nensis)是耐寒、耐旱、耐盐碱、耐践踏和营养很高的优良牧草,广泛分布在我国东北平原、华北地区和内蒙古东部高原。由于生态环境的差异,引起羊草生态型的分化。卢萍[29]对兴安盟不同地理及生态环境下羊草酯酶同工酶研究发现,不同地理及生态环境下的羊草种群存在着种内分化。陈世龙[25]对内蒙古东部地区不同类型草原羊草的过氧化酶和细胞色素氧化酶的同工酶的研究表明,羊草随地理生态条件发生不同程度的种内分化,但在总体上却保持着较大程度的一致性。张丽萍等[13]对来自同一天然草地上两种叶色的羊草不同器官的过
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生态学杂志 第22卷 第6期 氧化物酶和酯酶同工酶进行分析比较,得出两类羊草叶色的差异只是形态上的变异的结论。汪敏等[5]对我国从内蒙古到吉林的荒漠草原、典型草原、草甸草原和盐碱地草原的5个样点上羊草的6种同工酶进行了研究发现、羊草种群随着地理生态环境的不同,在同工酶水平上发生着不同程度的种内分化,但这种在同工酶水平上的分化受多个环境因子的综合影响,而不仅仅是水分因子,可能与羊草抗寒性有关,同时指出,由于基因的作用和差别表达[28],会造成同一植株的同工酶随着不同的发育时期和环境条件的改变而出现酶谱上差异。汪敏[5]曾对5个样点,40、60和90日苗期的羊草进行6种同工酶谱测定,其结果完全一样,未出现任何分异,而40日苗期的羊草除G DH、ADH同工酶外,其余的PER、EST、AM Y、IDH同工酶都发生不同程度上分化。因此羊草同工酶研究的材料最好小于40日苗期,而10日期的羊草是各发育期中酯酶同工酶谱中条带数较多和差异最大的[5]。王振英等[3]以强耐盐,一般耐盐和盐敏感3种水稻为材料,在盐胁迫下进行了RAPD和POD同工酶检测,结果POD 同工酶变化的总趋势是具强耐盐的水稻ρ(Nacl)= 10g・L-1胁迫后,POD同工酶增加,而对盐敏感的水稻侧根系内POD同工酶减少,一般耐盐与正常品种根内POD同工酶比较稳定或略有减少现象。实验表明,POD同工酶的变化水稻耐盐与盐敏感特性存在一定的相关性POD同工酶是一种对外界不良环境条件十分敏感的酶。环境中高浓度的盐可以诱导或抑制某些同工酶的产生。一些学者把这些特性称做“适应性”的反应[52]。夏丽华等[37]利用外磁场处理羊草种子结果表明,磁场能激活羊草POD活性,而且还会诱发新酶带的产生,酶活性提高幅度较大及同功酶染色较深的是300m T磁场处理和200 m T磁场处理。李卓杰等[16]探讨了珙桐(Davi dia i nvol ucrata)种子休眠和萌发过程中酸性磷酸酶的动态变化。在研究植物的生长发育过程中,由于过氧化物酶在植物中存在普遍,而分离简便易行,相应地研究得较深入。同工酶在植物体内的普遍存在以及与生长发育的关系提供了基因表达的灵敏指标,若能在同工酶的出现与变异方面找出其与生长发育之间的关系,就能更好地生长发育的进程[12]。313 在云杉研究中的应用
云杉作为我国西部及北方造林重要树种和城市优质行道树,一直倍受科研工作者的青睐,在同工酶研究方面也是如此[42]。
通过对不同产地云杉(Picea koraiensis)脂酶酶谱的比较,杜晓明等[17]发现红皮云杉分布广泛,分析得出其α2酯酶同工酶共有12种酶谱,不同产地酶谱种类及数量不同。在我国以小兴安岭的红皮云杉酶谱最高,并以此为中心向外逐步减少,存在着分子水平上的多态现象。依不同产地红皮云杉脂酶同工酶酶谱聚类分析结果说明,基因型的形成呈现出与地域分布的一致性。在种源试验中,不同产地的表型差异受遗传型和试验地条件的双重控制,在环境条件中产地与试验地气候环境差异幅度则起重要作用。通过α2酯酶同工酶的分析可以对各不同产地进行遗传型区划,并依据表型与遗传型、气候区的相互关系为不同地点优良种源的早期选择提供重要依据。
罗建勋等[27]通过研究云杉不同种源的苹果酸脱氢酶(MDH)同工酶的遗传变异,得到结果,不同种源的MDH的酶带有较大的差异,不同的地理、生态气候因子如海拔、纬度、经度等均会影响云杉同工酶酶谱的某些复等位基因的分化,即弱带有差异而强带变化不大。不同种源的同工酶形成与不同生态环境相对应的特征谱带。云杉种源间MDH酶带的变异主要随海拔梯度和纬度地理变化。MDH酶带显现在3个区域,表明其受3个位点控制。中间位点控制的染色区域中的酶带较稳定,可视为云杉特有的主要标志。将另外两个位点控制的酶带区域视为非标志带,酶带的变异往往表现在非标志带上,造成它在酶带数目及迁移率上存在差异(质的差异)或酶相对活性上不同(量的差异)。不同生境下形成的特征谱带可能就是因为各生态因子致使属的非标志带发生修饰而形成。从分子生物学角度讲,造成基因突变的原因主要是遗传背景,环境不是其变异的主要原因。不过,环境的差异可能影响某些基因分化,使某些等位基因系列(复等位基因)中的等位基因变成无效等位基因或反之,从而就形成与环境相对应的特征谱带。
在内蒙古白音敖包自然保护区存在一片天然的沙地云杉林,从地理分布和形态解剖结构上与红皮云杉和白扦云杉(Picea meyeri))很难区别,并一度出现了分类上的混乱。徐文铎等[35]系统地研究了这三种云杉在同工酶、染色体及核型等方面的区别。选择酯酶同工酶,利用聚丙烯酰胺电泳分离比较清晰的酶带,沙地云杉共有13条带,而红皮云杉和白
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邹春静等:同工酶分析技术及其在植物研究中的应用木千云杉各有12条带。按照从负极到正极酶带分布的位置集中程度,三种云杉也有十分明显的差别。研究结果为沙地云杉(Picea mongolica)的确立提供了非常有利的证据。结合其它宏微观指标最后确定沙地云杉为我国特有新种,引起了国内外同行的广泛关注。
同工酶的多种分子形式的时间特异性和组织特异性在植物中普遍存在,植物体内各种酶的同工酶酶谱随着细胞分化、组织器官及植株的生长、成熟而发生规律性的变化。这种变化在一定程度上反映了植物在发育过程中基因表达的时空顺序性,因而同工酶的酶谱特征可以作为植物组织培养的一种生化指标。杨金玲等[21]开展了白扦云杉体细胞胚胎发生过程中过氧化物酶及酯酶同工酶的研究。发现体细胞胚发育过程中的过氧化物同工酶酶谱一共有17条酶带。第一时期(胚性胚柄团时期)有12条酶带,其中A4、B2、B7、B9着色深而宽,其余酶带着色浅而窄。随着体细胞胚的成熟,A4、B9着色逐渐加深。B2至第二时期(球形至鱼雷形胚时期)着色变得浅而窄,第三时期(子叶出现期)完全消失,第四时期(体细胞胚成熟期)又重新出现。第二时期比第一时期多4条酶带。从整体变化趋势来看,体细胞胚发育过程中,过氧化物同工酶酶带着色逐渐加深。对于酯酶同工酶来说,体细胞胚发育的第一时期仅有1条清晰酶带A1。第二时期增加到5条:A1、B1、B2、B3、B5,其中A1比第一时期加深且变宽。第三时期有4条酶带:A1、A2、B2、B5,着色极浅,且A2、B2和B5都轻度扩散,A2是这个时期特有的酶带。第四时期有6条酶带:A1、B1、B2、B3、B4、B5,着色都较深。在体细胞胚的整个发育过程中,共有的酶带A1着色逐渐加深。酶带着色程度的整体变化规律也是逐渐加深。由此可见,酯酶同工酶酶谱及其活性的变化趋势与过氧化物酶基本一致。这样作为组织培养中形态建成的指标,过氧化物酶及酯酶同工酶酶谱的变化的确是有规律可循的。
张军丽等[8]对长白山红皮云杉自然群体同工酶遗传型进行了分析。G abriele等[46]应用随意进行扩增的DNA多态性(Random Amplified Polymor2 phlic DNA,RAPD)分析研究了欧洲云杉(Picea a2 bies)种群内同工酶的遗传型。Roman等[54]利用同工酶分析技术研究了挪威云杉(Norway spruce)基因库对大气污染的选择效应。Sagnard等[55]应用同工酶分析技术研究了阿尔卑斯山西南部的一种冷杉(A bies alba)的遗传多样性结构,为生物多样性保护提供了科学依据。Scotti等[56]应用序列特征扩增区标记(Sequence2characterized amplified region (SCAR)markers)分析和同工酶分析技术研究了欧洲云杉的分子生态学问题。
4 结 语
同工酶分析技术从首次被提出到现在已经将近50年了,随着科技的发展这一技术也越来越成熟,在这几十年中,同工酶分析技术在分子水平的科学研究上起了十分巨大的作用,在动物、植物、微生物、农业和医学等许多方面都有广泛的应用,也取得了极为显著的成果。对分析生物繁殖、体细胞杂交、染色体倍性、基因分化和表达、生物多样性保护等,提供了一个新的、非常广阔的前景,对其进一步的研究和应用,不仅在基础理论研究上,而且在生产实践上均具有十分重要的意义。虽然在未来可能有更加先进的分析技术,但是就目前来说,同工酶分析技术还是最简单方便的,而且随着技术的不断提高,同工酶分析技术应用的领域也会愈加宽阔。
参考文献
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作者简介 邹春静,男,1968年生,1997年7月中国科学院沈阳应用生态研究所生态学专业博士毕业,副研究员。目前主要从事沙地森林生态学和植物生理生态学的科研工作。发表论文60余篇和著作2部。
责任编辑 王 伟
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邹春静等:
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