碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)是一种非特异性磷酸单酯酶，能催化磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖，也能催化磷酸基团的转移反应。AP广泛存在于微生物和动物体内，在磷生物地球化学循环过程中有重要作用，并广泛应用于诊断学、生物化学及分子生物学等领域。

    1 大肠杆菌碱性磷酸酶

    20世纪80年代相继完成了大肠杆菌AP、人胎盘型AP、人肝/骨/肾型AP、人小肠型AP和酿酒酵母AP氨基酸序列的测定，通过序列比较发现相似性为25%~30%，活性部位高度保守，都保留了Ser102残基、Arg166及金属离子配体，这些保守的与催化活性相关的基团暗示了不同来源的AP具有相似的作用机制。另外，功能相似的磷酸二酯酶，如蜡状芽孢杆菌中的磷脂酶C、桔青霉中核酸酶P1，它们的活性部位和金属离子结合位点与大肠杆菌AP相似。所以，大肠杆菌AP还可作为其它磷酸酯酶和以金属离子作辅助因子的磷酸酯酶的研究模型。

    AP确切的生理功能还不十分清楚，但认为它对有机体内磷代谢的调节有重要作用。大肠杆菌AP的结构基因是phoA，它是pho调节子的一部分，pho调节子主要调节磷的转运和代谢。Phobox是pho调节子所有基因启动子区域的共有序列，受PhoB蛋白的。phoB基因产物直接激活pho调节子的转录，而PhoB蛋白又被PhoR蛋白磷酸化激活。细胞外磷的水平是PhoR的信号，信号传递通过大肠杆菌Pst系统实现。当接收到环境信号后，PhoR再去调节PhoB，而PhoB就是大肠杆菌AP结构基因phoA的直接转录调节者。当处于低磷状态时，PhoR使PhoB磷酸化，激活大肠杆菌AP结构基因phoA的转录；当处于高磷状态时，PhoR会使PhoB去磷酸化以阻止phoA大肠杆菌AP结构基因的转录。

    2 哺乳动物碱性磷酸酶

    此外，哺乳动物碱性磷酸酶哺乳类AP和大肠杆菌AP基本三维结构框架非常相似，与催化活性相关的部位高度保守，2001年获得PLAP的X-射线晶体结构也证实了这一点，所以哺乳类AP与大肠杆菌AP应具有相似的催化机制。但哺乳类AP也有其特点，如哺乳类AP主要为膜结合蛋白，它们通过磷脂酰肌醇葡聚糖锚定在细胞膜外侧；另外，细菌AP是由单基因编码，而哺乳类AP则是多基因编码的，细菌的AP分子两个亚基完全相同，而哺乳类AP分子两个亚基可能不同。

哺乳类AP确切的生物学功能和作用机制还不十分清楚。目前认为骨骼的矿化依赖于正常的AP的活动，对此观点最直接的证据可能是低磷酸酯酶症。低磷酸酯酶症是一种先天性代谢紊乱的骨疾病，为TNAP编码的结构基因发生突变，使血液中AP活力低于正常水平，表现为骨化及骨发育不全，至今已有200多种TNAP突变基因型被报道，虽然还无法治愈，但最近间叶干细胞移植的成功为该病的治疗提供了新的途径。另外，在运输营养物质的组织中如小肠上皮刷状缘表面、胎盘合胞体滋养层表面、胆小管表面细胞膜上AP的含量很高，提示AP与磷酸的转移和代谢有关。总之，不同组织和器官的AP有不同的生理功能，但有一些仍然是未知的。

    3 碱性磷酸酶的应用

    AP在医学和分子生物学等领域有广泛的用途。在临床医学上，测定血清中AP的活力已成为诊断和监测多种疾病重要手段。AP主要用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查，患这些疾病时，肝细胞过度制造AP，经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍，反流入血而引起血清AP明显升高。而血中肠型AP明显升高可见于各种肠道疾病，也有文献报道某些消化系统疾病、自身免疫性疾病及恶性肿瘤患者血中还可以出现免疫球蛋白复合物型AP，此种AP同工酶出现的机理尚未清楚。AP同工酶作为肿瘤组织的一个标志也逐渐为人们所认识，如肺脏、睾丸、卵巢、胰腺、结肠和淋巴组织等恶性肿瘤病人血清中含有PLAP。骨型AP作为骨代谢异常的标志物越来越受到临床重视；血清骨型AP活力的定量测定可作为监测骨形成变化的有效参数，在其他的骨代谢异常疾病(如骨软化症、佝偻病等)及早期甲状腺机能亢进的病人、慢性肾衰病人、接受肾脏移植的病人血清中的骨型AP活性均有不同程度的改变，对骨型AP活性的检测及动态观察将为疾病的早期诊断、治疗效果的监测、病情预后等提供有效的依据。

    在动物饲养和疾病诊断方面，AP是反映成骨细胞活性、骨生成状况和钙、磷代谢的重要生化指标。钙、磷供应不足对动物的影响主要表现为骨结构异常、软骨病、食欲降低、生长迟缓、生产性能下降等。年幼动物血液AP主要来自骨骼，随着动物长大成熟和骨骼成年化，来自骨骼的AP逐渐减少。在动物营养研究中，血清AP活性常作为重要的生化检测指标协助评定日粮钙、磷水平的适宜程度。在动物疾病诊断上，依据骨质疏松等骨骼疾病发生时AP活性的变化规律，可应用血清AP活性来诊断因钙、磷及VD失调所引起的骨质疾病。临床骨型AP的检测比血钙测定体内钙营养水平更具敏感性，因此，国内外研究一致认为骨型AP是反映骨改变全过程最正确的指标，其特异性、灵敏度及准确性优于其它物质的检测。另外，在动物患肝疾患、胃肠疾患、肾脏疾病和缺锌时，血清AP均会有改变，如果继续对脏器特异性、AP变化机制、AP在不同动物体内生理功能深入研究，会使AP在兽医临床上意义更大。

    在免疫学研究方面，已广泛应用AP标记抗体进行酶联免疫荧光反应(ELISA)和Western印迹分析，即将AP与显色剂或去磷酸化后能发光的底物相互作用来揭示靶与检测酶复合物的存在，与辣根过氧化物酶相比，AP用作标记酶的优点是稳定性高、灵敏度高,缺点是成本高、标记困难。

在生物化学和分子生物学方面，用AP催化除去DNA分子的5c末端磷酸基团以防止载体自连是基因克隆中的常规手段之一。用AP脱去5c末端磷酸基团，再用(C-32P)ATP标记5c末端，可用于化学测序，RNA测序和特异性DNA或RNA片段的图谱构建。应用AP代替同位素标记核苷酸探针用于分子杂交。研究中最常用的AP有：（1）细菌碱性磷酸酶(BAP)；（2）SAP(来源于一种北极虾)；（3）小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)；（4）胎盘碱性磷酸酶(PLAP)和分泌性碱性磷酸酶(SEAP)，后者是前者的C末端短缺版，与PLAP相比，SEAP没有PLAP的C末端最后24个氨基酸(这24个氨基酸构成了与糖基化磷脂酰肌醇靶向锚定的区域)。另外，将phoA基因与其它基因融合表达杂合蛋白可用于基因表达的研究。目前工业上一个普遍的应用是基于巴氏杀菌可破坏AP，因此将AP作为检验牛奶的巴氏灭菌的标志。

4 展望

AP的研究已经有近百年的历史，对于AP的结构、功能、性质、作用机理、活性等方面的研究均已取得了不小的成就。近年来，科研工作者将研究目光聚焦在AP的生理功能及应用上，取得了许多新成果，如Lallˆs研究结果认为，肠型AP在保持肠道平衡中发挥重要作用，膳食可以影响它的活性，肠型AP具有参与调节碳酸氢盐分泌和十二指肠pH、通过脱磷酸作用控制细菌内毒素诱发的肠道炎症等功能。但对该酶在生物体内确切的生物学功能、工作机理，以及哺乳类AP的晶体结构分析等方面还有待进一步研究，相信随着科学的发展、科研手段的进步、对AP认识的不断深入，将使AP在科研和临床诊断中发挥更大的作用。 

参考文献：

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2　 Orimo H. The mechanism of mineralization and the role of alka-line phosphatase in health and disease [J].J Nippon Med Sch,2010,77(1):4~12.

3　Fernandez N J, Kidney B A. Alkaline phosphatase: beyond the liver[J]. Vet Clin Pathol, 2007, 34(9):68~70.

4　周新,涂植光.临床生物化学和生物化学检验[M].第3版.北京:人民卫生出版社, 2006.

5　王石莹,闫素梅1碱性磷酸酶在动物骨骼代谢中的研究进展[J].饲料博览, 2009(4):14~17.

6　 Lallˆs J P. Intestinal alkaline phosphatase: multiple biological roles in maintenance of intestinal homeostasis and modulation by diet [J]. Nutr Rev, 2010, 68(6):323~332.

   实验内容及目标：

1)质粒DNA的小量制备：提取表达载体pET-His

2)质粒DNA电泳鉴定

3)质粒DNA的酶切

4)PCR扩增制备目的基因

5)目的基因片段与载体连接

6)从琼脂糖凝胶中回收DNA片断

7)感受态菌的制备

8)细菌转化  

9)转化克隆的筛选和鉴定

10)外源基因的诱导表达      

11)SDS-PAGE检测表达蛋白

   关键问题：

a.IPTG诱导量及诱导时间的优化；

b.超声破碎的方案优化。

   实验思路：按照技术路线完成试验。

   实验方法：电泳 PCR扩增 原核诱导表达等。

   技术路线：

   可行性分析：实验室相关技术成熟，实验人员熟悉相关的实验内容以及方法，

实验的可行性很高。

准备：发放实验器材，摇pET-His，pMD-18T-NK。

第一天：提质粒并PCR扩增NK，然后与pMD19-T连接过夜。

第二天：作感受态DH5a。EcoRI和BamHI双酶切pET-His。pMD19-T-NK连接液转化DH5a涂板。回收pET-His。

第三天：挑p-T-NK平板克隆，摇菌。提质粒pMD19-T-NK。

第四天：EcoRI和BamHI双酶切验证。回收NK。NK与pET-His连接过夜。

第五天：pET-His-NK连接液转化DH5a，涂板。挑pET-His-NK克隆，摇菌。摇BL21(DE3)。

第六天：作感受态BL21(DE3)。提质粒pET-His-NK。Hind酶切验证。转化BL21(DE3)，涂板过夜。

第七天：摇菌[包括空BL21(DE3)]。练习组装SDS电泳模具。OD600=0.5时诱导表达3h，离心集菌。

第八天：灌胶加样电泳（2-3h），染色45min，脱色。观察脱色胶，转入清水，照相。

 1 获得目的产物BAP；

 2 成功构建BAP表达载体；

 3 撰写实验报告。

（学过基因工程课程、读过相关的文献、写过有关的综述、参加过相关的实验设计或研究课题、获得学术奖励情况等）

阅读相关文献书籍：

1)王秋颖. 碱性磷酸酶特性及其应用的研究进展[J]. 中国畜牧兽医, 2011, 38(001): 157-161.

2)旭芬. 基因工程实验指导[M]. 高等教育出版社, 2006.

3)李军, 黄霞, 姚雪梅, 等. E. coli DH10B 碱性磷酸酶基因的克隆, 表达及活性研究[J]. 中国医药导报, 2012, 9(1): 28-29.

                                           签字：

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