牛其云1,徐 冰2
(1.莱芜市药品检验所,山东莱芜271100;2.中国人民总医院,北京100853)
[中图分类号]R917 [文献标识码]B [文章编号]1671-5098(2005)06A-1441-03
高效毛细管电泳(Hig h Per for mance Capillar y Electr ophor esis,HPCE)是近年来发展较快的一种分离、分析技术,是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。HPCE 和高效液相色谱法(HP L C)相比,相同处在于都是高效分离技术,仪器操作均可自动化,且均有多种不同分离模式。差异在于,HP CE用迁移时间取代HPL C中的保留时间,分析时间通常不超过30min,比HPL C速度快;对HP CE而言,从理论上推得其理论塔板高度和溶质扩散系数成正比,对扩散系数小的生物大分子而言,其柱效就要比HP LC高得多;HPCE所需样品为nl级,最低可达270fl,流动相用量也只需几毫升,而HPL C所需样品为L l级,流动相则需几百毫升乃至更多;但HPCE仅能实现微量制备,而HPL C可作常量制备。HP CE和普通电泳相比,由于采用高电场,分离速度要快得多;检测器除了未能和原子吸收及红外光谱连接以外,其他类型检测器均可连接检测;一般电泳定量精度差,而HP CE和HP L C相近; HPCE操作自动化程度比普通电泳要高得多。
1 CE的优点
HPCE的优点可概括为三高二少:高灵敏度,常用紫外检测器的检测限可达10-15mo l～10-13mo l,激光诱导荧光检测器则达10-21mol～10-19mol;高分辨率,其每米理论塔板数几十万,高者可达几百万乃至千万,而HPL C一般为几千到几万;高速度,最快可在60s内完成,有250s内分离10种蛋白质, 1.7min分离19种阳离子及3min内分离30种阴离子的报道;样品少,只需nl(10-9L)级的进样量;成本低,只需少量(几毫升)流动相和价格低廉的石英毛细管。由于以上优点以及分离生物大分子的能力,使HPCE成为近年来发展最迅速的分离分析方法之一。当然,HPCE还是一种正在发展中的技术,有些理论研究和实际应用正在进行与开发。
2 HPCE的几种类型
HPCE可分析的成分小至无机离子,大至生物大分子,如蛋白质、核酸等。可用于分析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等,HP CE分析高效、快速、微量。根据其分离样本的原理设计不同主要分为以下几种类型:毛细管区带电泳(Ca pillary Zone Elect ro pho resis,CZE);毛细管等速电泳(Capillar y Isot achphor esis,CIT P);毛细管胶束电动色谱(M icellar Electr okinetic Capillar y Chr omat og rapy,M ECC);毛细管凝胶电泳(Capillary Gel Electr ophor esis,CG E);毛细管等电聚焦(Ca pillary Isoelect r ic F ocusing,CIEF)。目前CZE和M ECC用得较多,本文以这两种方法为例来说明HPCE的原理。
3 CZE的基本原理
HPCE选用的毛细管一般内径约50L m(20L m～200 L m),外径375L m,有效长度50cm(7cm～100cm),以高压电场为驱动力,以毛细管为分离通道,依据样品中各组分之间浓度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。其结构包括一个高压电源,一根毛细管,一个检测器及两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液贮瓶。在电解质溶液中,带电粒子在电场作用下,以不同速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫作电泳。HPCE所用的大理石英毛细管柱,在pH>3情况下,其内表面带负电,和溶液接触时形成了一双电层。在高电压作用下,双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象叫电渗,粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流(EOF)两种速度的矢量和。正离子的运动方向和电渗流一致,故最先流出;中性粒子的电泳流速度为“零”,故其迁移速度相当于电渗流速度;负离子的运动方向和电渗流方向相反,但因电渗流速度一般都大于电泳流速度,故在中性粒子之后流出,从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。
4 MECC的基本原理
M ECC是把一些离子型表面活性剂(如十二烷基硫酸钠, SDS)加到缓冲液中,当其浓度超过临界浓度后就形成有一疏水内核、外部带负电的胶束。虽然胶束带负电,但一般情况下电渗流的速度仍大于胶束的迁移速度,故胶束将以较低速度向阴极移动。溶质在水相和胶束相(准固定相)之间产生分配,中性粒子因其本身疏水性不同,在二相中分配就有差异,疏水性强的和胶束结合牢,流出时间就长,最终按中性粒子疏水性不同得以分离。M ECC使HPCE能用于中性物质的分离,拓宽了HPCE的应用范围,是对HPCE极大的贡献。
5 在体内药物分析中的应用
毛细管电泳分离模式多,分离效率高,速度快,适用范围广,所需样品、试剂用量少,在体内药物分析中得到广泛应用。
5.1 样品浓缩 近年来出现了各种在柱预浓缩技术,如场放大、电堆积富集、等速电泳聚焦浓缩、固相预浓缩、膜预浓缩等,大大提高了HPCE的检测灵敏度。其中,场放大样品富集(Field-A mplified Sample Stacking,F ASS)技术操作方便,灵敏度提高显著,在体内药物分析中应用极为广泛。样品浓缩技术是采用特殊的进样过程将大体积样品溶液中的痕量被测物浓缩后进行分离,从而提高检测灵敏度的一种技术。毛细管电泳中的样品浓缩技术有柱上浓缩与柱前浓缩之分:柱上浓缩是在不改变毛细管电泳系统时进行,将大体积样品直接引入分离毛细管后,在电泳前采取适当的措施进行浓缩,然后直接进行电泳分离;柱前浓缩是在改变毛细管电泳系统时进行,一般在分离毛细管前增加一段预柱,大体积样品首先被引入预柱中采取适当措施进行浓缩,然后部分或全部被引入分离毛细管柱中进行分离。Eap等[1]采用F A SS技术对血样中的四环类抗抑郁药物进行富集,测定了米安色林(mian serin)、去甲米安色林、8-
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实用医技杂志2005年6月第12卷第6期上半月版 JP M T,June.2005,V ol.12,No.6A羟基米安色林及其对映体的血药浓度。在进样前以流体动力进样法引入一小段水柱,加压到5kV后,该区场强增高,使待测物快速迁移入毛细管,在水柱和背景电解质交界处进行富集。米安色林和去甲米安色林的L OQ为5L g/L,8-羟基米安色林的L OQ为15Lg/L,检测快速,适用于治疗药物监测。So ng 等[2]采用该技术测定了血液中的二甲双胍,还指出由于待测物的极性很大,血液中的带电离子和蛋白质会影响富集效果,所以生物样品测定前的去蛋白和萃取很重要。L iu等[3]采用M EK C方法,对1、2、4、7和1、2、4、8T CDDs进行了测定,灵敏度比原来提高一个数量级。采用柱上富集技术后,可以加大进样量而不影响分离,进样量达80nl～160nl。Zhang等[3]采用柱头F A I分离检测血浆中痕量乙胺碘呋酮及其代谢物去乙基乙胺碘呋酮,检测限达70nmol/L。临床样品测定结果与HPL C相符,而本法测定时间仅需10min,比HPL C更适用于快速临床测定。T omlinson等[4]采用mPC-CE-M S分析病人服用小剂量强安定药氟哌啶醇后尿样中代谢物,进样10L l,用80nl甲醇洗脱膜上待测物,可测出氟哌啶醇及其3种代谢物。与常规CE相比,进样量大大增加。
5.2 治疗药物检测 药物测定,样品多为血清、血浆、尿液和唾液,因而需要进行样品预处理,其处理方式分两类:一类为直接进样即用蛋白沉淀剂除去蛋白质干扰,或将样品离心用微孔滤膜过滤,取滤液直接进样。另一类为萃取法,一般沿用色谱分析中的液相萃取和固相萃取。HP CE适应于多种临床常规用药的检测。史爱欣等[5]建立了人血浆中班布特罗及其代谢物特布他林血药浓度的高效毛细管电泳测定方法。具体方法:运行缓冲液为80mmo l/L磷酸二氢钠缓冲液(用磷酸调pH=3.15);电压进样:10kV,10s;运行电压25kV,检测波长为200nm,采用固相萃取的方法进行班布特罗及其代谢物特布他林的提取。结果:班布特罗及其特布他林峰形良好,且血浆组分无干扰峰,采用普萘洛尔为内标,班布特罗测定的线性范围为16L g/ L～125L g/L,特布他林测定的线性范围为40L g/L～3125 L g/L。本法的日内RSD<11%,日间RSD<12%。夏东亚等[6]的高效毛细管电泳法测定人血清中美罗培南浓度。血清样品用乙腈沉淀蛋白。以头孢哌酮为内标,运行缓冲液为66m mol/L 磷酸盐缓冲液(pH= 5.8);正极压力进样,进样压力5kP a×10s;分离电压30kV,柱温25℃,检测波长297nm。美罗培南及内标与血清中其他内源性杂质完全分离,在5mg/L～200 mg/L范围内美罗培南/内标的峰面积比与浓度呈良好的线性关系;方法回收率98.45%～101.42%;日内和日间测定RSD 分别小于8%和14%;最低检测浓度为4mg/L。本方法简便、快速、准确。
5.3 药代动力学研究 李朵璐等[7]对左氧氟沙星(L VF X)和多索茶碱(D ox)合用在大鼠体内的药代动力学进行研究。用胶束电动毛细管电泳法(M ECC)检测Dox的血药浓度。测定了单用和合用D ox的药代动力学参数,结果表明单用和合用Dox 均符合二房室模型。余丽宁等[8]建立了快速、准确测定大鼠血浆中马来酸曲美布汀浓度的HPCE方法,并用于其在大鼠体内的药物动力学研究。以盐酸麻黄碱为内标,0.03mo l/L磷酸二氢钠(pH=
6.0)为运行缓冲溶液,紫外检测波长为214nm。血浆样品经乙腈除蛋白后,于50℃水浴用氮气吹干,残渣溶于甲醇水(1∶1),进样分析。线性范围5L g/L～200L g/L,日内RSD<14%,日间RSD<13%,回收率为728%～879%,最低定量浓度为5L g/L。ig给药30min后,血浆中药物浓度达峰值,T1/2(K e)为173min,K e为56×10-3/min,A U C为783L g/ (min・ml)。该方法灵敏度高,操作简便,适用于马来酸曲美布汀的药物动力学研究。史爱欣等[9]高效毛细管电泳法研究盐酸班布特罗国产胶囊与进口片剂的人体生物等效性,研究国产盐酸班布特罗胶囊和进口片剂的人体生物等效性。采用高效毛细管电泳法测定血浆中班布特罗及其代谢物特布他林的浓度。测定了单次口服国产班布特罗胶囊和进口班布特罗片剂后班布特罗的药代动力学参数:AU C0t分别为(71±18)L g/(h・L)和(72±13)L g/(h・L),实测Cmax分别为(81±18)L g/L和(92±23)L g/L,实测T max分别为(36±13)h和(37±10)h。特布他林药代动力学参数:A U C0t分别为(129±33)L g/(h・L)和(130±34)L g/(h・L),实测Cmax分别为(78±23)L g/L和(85±29)L g/L,实测T max分别为(54±8)h和(56±11)h,国产班布和进口班布特罗片剂后班布特罗具有相同的生物等效性。
5.4 手性药物的拆分与监测 药物的手性是指药物分子内部的一种不对称性,手性药物异构体间的药理活性往往存在质和量的差异。因此,手性药物的拆分和监测也受到越来越多的关注,刘会臣,于洋等[10]研究反式曲马朵(tr ansT)及反式氧去甲基曲马朵(M1)在大鼠胆汁中排泄的立体选择性。以高效毛细管电泳法测定大鼠ivtr ansT或M1后胆汁和血浆中tr ansT, M1和与葡糖醛酸结合M1(M1c)的对映体。大鼠iv transT后,胆汁中(+)tr ansT水平较(-)tra nsT高,(+)(-)tr ansT较血浆中(+)(-)tr ansT的比值小。大鼠iv M1后,胆汁中(+) M1水平较(-)M1高,(+)M1c较(-)M1c低,(+)M1与葡糖醛酸的结合率较(-)M1低。结果表明t ransT和M1在大鼠胆汁中排泄具立体选择性,(+)t ransT和(-)M1被优先排泄,李晓海等[11]-叶 碱的高效毛细管电泳手性分离及其大鼠体内立体选择性代谢研究以羟丙基-B-环糊精(HP-B-CD)为手性选择剂,测定条件为:分离介质32m mol/L HP-B-CD的T ris H3PO4缓冲液(40mmol/L,H3PO4调至pH=
6.0);分离电压15kV,柱温16℃,压力进样6s,检测波长254nm;大鼠各生物样品碱化后乙酸乙酯萃取。测定条件下SE基本达到基线分离,大鼠生物样品测定不受内源及代谢物干扰。大鼠ipSE经胆汁、尿和粪排泄以d型为主,具有立体选择性。
6 展望
目前,体内药物分析的药代研究、治疗药物监测等,主要应用HP LC,但采用HPL C时,样品预处理既费时又费力,平衡时间和分析时间较长,且耗用大量流动相。从发展趋势看,CE具有高效、价廉等优点,适于普及。通过对样品进行浓缩预处理,可提高检测灵敏度,同时CE技术如何与其他方法和技术如HPL C、M S等联合应用,是今后的研究方向和课题。CE-N M R 联用技术近年来也受到了关注。P usecjer等[12]分别将毛细管区带电泳(CZE)和毛细管电色谱(CEC)与N M R仪联用,测定尿
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实用医技杂志2005年6月第12卷第6期上半月版 JPM T,June.2005,Vo l.12,N o.6A液中的对乙酰氨基酚及其代谢物。受试者服药1g后,3h内取尿样,加入甲醇2HCl溶液,先在C18固相小柱上进行预处理,再用酸洗脱进行分析。CZE采用内径80L m的毛细管柱,进样8nl,CEC采用内径为250L m的填充毛细管柱,进样500nl, N M R仪频率600M Hz,检测出了药物的主要代谢物及内源性的马尿酸盐,分离效率高且物质结构明确,令人满意。可以预言,经过科学工作者的不懈努力及深入研究,CE技术将得到不断发展和完善,随着商品化仪器的不断改进,CE将成为体内药物分析的重要工具。
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(收稿日期:2005-04-18)
弹性酶治疗非酒精性脂肪肝20例临床观察
庄肃安,陈 凯,李德瑞
(山东医专附属医院,山东临沂276004)
[摘 要]目的:探讨弹性酶治疗非酒精性脂肪肝(N A FL)的疗效。方法:2001年3月至2004年3月我院选择经B 超和(或)CT证实的N A FL患者19例,用弹性酶治疗,剂量每次30mg,每日3次口服,疗程12周,治疗前后测定肝功能、血清总胆固醇、甘油三酯、空腹血糖,并行B超和(或)CT检查。结果:治疗后患者血清丙氨酸氨基转移酶(AL T)、天冬氨酸氨基转移酶(A ST)、r-谷氨酰转肽酶(G GT)显著降低(P<0.01),空腹血糖、总胆固醇和甘油三酯也有降低(P<0.01),B超和(或)CT发现脂肪肝有一定程度改善,治疗期间无明显毒副作用。结论:弹性酶治疗N A FL有效,且安全,值得深入研究。
[关键词]弹性酶;非酒精性脂肪肝;临床观察
[中图分类号]R575.5 [文献标识码]A [文章编号]1671-5098(2005)06A-1443-02
A Pilot Study of the Effect of Elastase on Patients with Nonalcoholic Fatty Liver
ZHU ANG Su-an,CHEN Kai,LI De-r ui
(H osp ital A f f iliated to S hand on M edical Colleg e,L iny i,Shandong276004,China)
Abstract:Objective T o inv estig ate the effica cy and safet y o f elast ase in this diso rder.Methods Nineteen pat ients w it h no nalco ho lic fatty liv er v erif ied by B ult rasound and(or)computed to mog r aphy w er e included in this pilo t study.
V iral alco holic,auto immune and o ther hepa tic diseases w er e ex cluded.pat ients w er e g iv en90m g of elasta se da ily for3 m onths.M easur ement of liv er functio n,serum lipid pro file,fast bloo d gluco se,and B ultr asound and(o r)com puted t o-m og raphy ex amination wer e done befo r e a nd after three-month tr eatment.R esults A sig nificant decr ease in the ser um levels o f alanine amino tr ansfer ase,aspar tat e aminotr ansfer ase and r-g lutamy l tr anspeptidase(P<0.01) o ccur red after elasta se t reatment.T he fast blood g lucose and ser um tota l cholestero l a nd tr ig ly cer ide lev els w er e also r educed(P<0.01).Similarly,B ultr asound and(o r)computed tomo gr aphy examinatio n sho w ed the degr ee o f steat osis w as par tly impro ved aft er3-month trea tment.Concl usion Elasta se is a safe and w ell t olerat ed dr ug that leads t o a sig nificant im pr ov ement in pa tients with nonalco holic fatty liver.
Key words:Elastase;N onalcoholic fatt y liv er;Clinical obser ve
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实用医技杂志2005年6月第12卷第6期上半月版 JP M T,June.2005,V ol.12,No.6A下载本文
