配制：

SE缓冲液：0.15mol/L 氯化钠，0.1 mol/L乙二胺四乙酸钠（EDTANa2）pH8.0

    100ml        0.8766g                   3.722g   

TE缓冲液：10mmol/L Tris.CL, Ph7.5, 1mmol/LEDTA, pH8.0

10mmol/L Tris.CL  15.7g

1mmol/L EDTA   29.224g

RNase A（核糖核酸酶）：用：0.15mol/L 氯化钠（pH5.0）溶解成2mg/mL 的溶液，沸水浴处理10min，灭活可能污染的DNase(脱氧核糖核酸酶)。

大豆胰蛋白胨琼脂（TSA）和大豆胰蛋白胨肉汤（TSB）购自生物梅里埃公司

2%盐酸 

饱和苯酚（tris平衡酚，PH≥7.8）

RNase A，SDS为AMRESCO公司，其余试剂为国产分析纯。

步骤：

挑单克隆培养物接种于5 mL TSB 液体试管培养24h，然后接种含有150mL 的TSB液体培养基的三角瓶中, 振荡培养48-72h（监测OD值，取200ul菌液，加入甲醛至终浓度为3％，灭活半小时，然后测定OD值，以培养基做对照，OD值应达到2.5以上）。80度灭活1h，将细菌培养液转移入2个50mL 离心管中（用Beckman高速冷冻离心机自带的离心管），7000rpm 离心8min，弃上清；如此重复若干次集菌。

根据菌体量加入5～10mL 的SE 缓冲液，加入10mL 的10％SDS（每克菌加SDS 0.2g），充分混匀，65℃水浴5～10min，使成粘稠清亮裂解液（期间不断摇动）。加入等体积的饱和苯酚（tris平衡酚，PH≥7.8）：氯仿（1:1）混合液，充分振荡混匀，10000rpm 离心10min，将上清转移至另一离心管，加等体积的氯仿，充分混匀，10000rpm 离心10min；根据残留蛋白的量，可重复抽提一次。

将上清转移至另一离心管中，加RNA 酶至终浓度为50～100μg/mL，37℃下作用1h。加入等体积的氯仿，充分混匀，10000rpm 离心10min，取上清于无菌烧杯中。沿烧杯壁缓慢加入两倍体积的冷无水酒精，同时用无菌玻棒搅拌，绕出DNA。用75%的乙醇润洗玻棒上的DNA，晾干DNA，溶于适量的TE（pH8.0）中（先用0.8mlTE把DNA从玻璃棒吹洗下来，洗到1.5ml管中，取1ul测浓度，用TE做对照），用紫外分光光度计（NANODROP 1000） 测定DNA 吸光度值，确定DNA 的浓度。然后标注浓度，时间等后-20°C备用。

注意：1 饱和酚为PH7.8以上的，要吸取下层。

2 溶解DNA后要室温放置1-2天，等完全溶解后才保存，期间不定时震荡助溶。

3  每次试验后离心管用2%盐酸浸泡后才能用。

每株菌所需DNA的量至少500ug，以满足本课题实验需要。

方法二：试剂盒提取

国家CDC拿的菌（或者我们自己转接到100ML 中集的菌），后分3管提。

基因组提取：采用Promega的WizardGenomic DNA Purification Kit 进行提取。

1 加600 ul的Nuclei Lysis Solution，然后轻轻混匀，使细菌裂解；

2 于80°C水浴中孵育5min,冷却至室温；

3 加3ul的Rnase Solution ,混匀，于37°C孵育15-60min，冷却至室温

4 加200ul的Protein Precipitation Solution ,漩涡混匀

5 冰上孵育5min

6 13000-16000g 离心3min

7 将上清转移至新的EP管中（特别注意不要吸到沉淀，最好留多点上清不要，这样蛋白会明显减少很多），加入600ul异丙醇，混匀，沉淀DNA；

8 13000-16000g 离心2min，弃上清；

9 加600ul 的70%乙醇，混匀

10 13000-16000g 离心2min

11 吸出乙醇，将EP管底的DNA沉淀在空气中干燥10-15min；

12 用100ul Rehydration Solution 重悬DNA， 4°过夜，彻底溶解DNA。测定浓度。

如果测定后发现蛋白高，用苯酚：氯仿重新去蛋白：

加入等体积的饱和苯酚（tris平衡酚，PH≥7.8）：氯仿（1:1）混合液，充分振荡混匀，14000rpm离心10min，将上清转移至另一离心管，加等体积的氯仿，充分混匀，14000rpm离心10min；将上清转移至另一离心管中，加2倍体积无水乙醇混匀后，14000rpm离心5min加2倍体积70%乙醇洗涤后，离心去上清。Rehydration Solution 重悬DNA溶解。下载本文