7月2日，国家药品监督管理局、国家卫生健康委发布公告，正式颁布2020年版《中国药典》，新版药典将于今年12月30日起正式实施。新版药典对环境监测、无菌检查方法、微生物检测、灭菌验证等都做出了相关要求。本文结合了《医疗器械无菌试验检查要点指南》中的检查内容，对新版《中国药典》中关于无菌检查法的要点进行了整理，供大家参考。

1、无菌检查要求

（1）无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

（2）单向流空气区域、工作台面及受控环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。

（3）日常检验需对试验环境进行监测。

注意：“受控环境”主要的关注指标应该是悬浮粒子、浮游菌和沉降菌受控，其他如压差、温湿度等的指标和监测频度也应满足《药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则》的要求。

2、培养基的制备及培养条件

（1）培养基可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基或商品化的预制培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

（2）制备好的培养基若不即时使用，应置于无菌密闭容器中，在2~25°C 、避光的环境下保存，并在经验证的保存期内使用。

注意：新版药典将“成品培养基”调整为“商品化的预制培养基”。新版药典不再强调“非密闭-三周”、“密闭-一年”的规定，便于企业实践掌握；但企业应最好具备稳定的验证过程和结果，以支持封闭条件和保存周期。

3、培养基的适用性检查

无菌性检查每批培养基一般随机取不少于5 支（瓶），置各培养基规定的温度培养14 天， 应无菌生长。

注意：应考虑实践中用于无菌性检查培养的试管装灭菌培养基与无菌检验用的三角瓶装培养基在灭菌方法验证时的两种包装的温度、F0等结果。

4、菌种

培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存和确认， 以保证试验菌株的生物学特性。

5、菌液制备

（1）接种金葡、铜绿、枯草的新鲜培养物至胰酪大豆陈液体培养基中或胰酪大豆陈琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35°C培养18~24小时。

（2）接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上， 20~25°C培养2~3天， 上述培养物用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或0.9％无菌氯化钠溶液制成适宜浓度菌悬液。

（3）接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，20~25°C培养5~7天或直到获得丰富的孢子，加入适量含0. 05%(ml/ml) 聚山梨酯80的pH7. 0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9%无菌氯化钠溶液 ,将孢子洗脱。

（4）采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，制成适宜浓度的孢子悬液。

（5）菌悬液若在室温下放置，一般应在2小时内使用；若保存在 2～8℃可在 24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃,在验证过的贮存期内使用。

注意：白色念珠菌的培养时间由原来的24~48小时调整为2~3 天；菌悬液不再强制要求100cfu/ml以下；洗黑曲孢子的聚山梨酯80的溶液不再强制3~5ml，而应根据孢子的喷落量灵活调整。

6、培养基接种 （1）取适宜装量的硫乙醇酸盐流体培养基7支，分别接种不大于l00cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照.（2）取适宜装量的胰酪大豆胨液体培养基7支，分别接种不大于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照。（3）接种细菌的培养管培养时间不超过3天，接种真菌的培养管培养时间不得超过5天。逐日观察结果。注意：真菌的培养时间要稍微长，其他的应控制在3天之内，时间长了容易污染环境或造成其他实验室危害。7、方法适用性试验进行产品无菌检查时，应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进行方法适用性试验。

6、薄膜过滤法

（1）按供试品的无菌检查要求，取每种培养基规定接种的供试品总量，采用薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入不大于100cfu 的试验菌，过滤。

（2）加培养基至滤筒内， 接种金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、生孢梭菌的滤筒内加硫乙醇酸盐流体培养基；接种枯草杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的滤筒内加胰酪大豆脉液体培养基；另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。

（3）置规定温度培养，培养时间不得超过5 天。

7、直接接种法

（1）取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基6 管，分别接人不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各2 管；取符合直接接种法培养基用量要求的胰酪大豆脉液体培养基6 管，分别接人不大于100cfu的枯草芽抱杆菌、白色念珠菌、黑曲霖各2管。

（2）1 管按供试品的无菌检查要求，接入每支培养基规定的供试品接种量，另1 管作为对照，置规定的温度培养，培养时间不得超过5 天。

8、结果判断 

（1）与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用，可以忽略不计，可照此检验方法和检查条件进行供试品的无菌检验。

（2）如含有供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该实验条件下有抑菌作用，应采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法适用性试验。

（3）方法适用性试验也可与供试品的无菌检查同时进行。

9、供试品的无菌检查

（1）供试品的无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。

（2）只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。

（3）供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与方法适用性试验确认的方法相同。

（4）无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。

供试品的无菌检查1、检验数量 （1）检验数量是指一次性试验所用的供试品最小包装容器的数量，成品每亚批均应进行无菌检查。（2）除另有规定外，出厂产品按表1规定；上市产品按表2规定。表1、表2中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。表1 批出厂产品及生物制品的原液和半成品最少检验数量

表2 上市抽验样品的最少检验数量

2、检验量  （1）检验量是指供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量。（2）除另有规定外，供试品检验量按表3规定，若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两种培养基，则应分别接种硫乙醇盐酸流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基。（3）采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许，应将所有容器内的内容物全部过滤。表3 供试品的最少检验数量

3、阳性对照 （1）应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。（2）阳性对照试验的菌液制备同方法适用性试验，加菌量不大于100cfu , 供试品用量同供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量。（3）阳性对照管培养不超过5 天， 应生长良好。注意：阳性对照的培养时间由原来的72小时内，调整为“不超过5 天”，考虑了特殊情况下阳性菌生长慢的情况。

4、阴性对照 （1）供试品无菌检验时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为硬性对照。（2）阴性对照不得有菌生长。

5、供试品处理及接种培养基 操作时，用适宜的方法对供试品容器表面进行彻底消毒，如果供试品容器内有一定的真空度，可用适宜的无菌容器材（如带有除菌过滤器的针头）向容器内导入无菌空气，再按无菌操作启开容器取出内容物。

除另有规定外，按下列方法进行供试品处理及接种培养。

薄膜过滤法

● 一般应采用封闭式薄膜过滤器，根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45μm 。

● 滤膜直径约为50mm, 若使用其他尺寸的滤膜，应对稀释液和冲洗液体积进行调整，并重新验证。

● 使用时，保证滤膜在过滤前后的完整性。

● 水溶性供试液过滤前，一般应先将少量的冲洗液过滤，以湿润滤膜。

● 油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。

● 为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。

● 供试液经滤膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100ml, 总冲洗量一般不超过500ml, 最高不得超过1000ml, 以避免滤膜上的微生物受损伤。

1）水溶性液体供试品 

a.取规定量，直接过滤，或混合至含不少于100ml的适宜稀释液的无菌容器中，混匀，立即过滤。

b.如供试品具有抑菌作用，需用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于3次，所用的冲洗量、冲洗方法同方法适用性试验。

c.除生物制品外，一般样品冲洗后，1份滤器中加入100ml硫乙醇盐酸流体培养基，1份滤器中加入100ml胰酪大豆胨液体培养基。

d.生物制品样品冲洗后，2份滤器中加入100ml硫乙醇盐酸流体培养基，1份滤器中加入100ml胰酪大豆胨液体培养基。

2）水溶性固体和半固体供试品  

取规定量，加适宜的稀释液溶解或按标签说明复溶，然后照水溶性液体供试品项下的方法操作。

注意：“半固体供试品”为新增样品类型。

3）可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂供试品  

a.取规定量，混合至适量的无菌十四烷酸异丙酯中（无菌十四烷酸异丙酯的制备可采用薄膜过滤法过滤除菌，选用孔径为0. 22μm 的适宜滤膜，或其他适宜的灭菌方法），然后应剧烈振摇，使供试品充分溶解。

b.如果需要可适当加热，加热温度一般不超过40°C，最高不得超过44°C，然后趁热过滤。

c.对于仍然无法过滤的供试品，于含有适量的无菌十四烷酸异丙酯中的供试液中加入不少于100ml的适宜稀释液，充分振摇萃取，静置，取下层水相作为供试液过滤。

d.过滤后，冲洗及接种培养基按照非水溶性制剂供试品项下的方法操作。

4）具有导管的医疗器械（输血、输液袋等）供试品 

a.除另有规定外，取规定量，每个最小包装用适量的（通常50~100ml) 冲洗液分别冲洗内壁，收集冲洗液于无菌容器中，然后照水溶性液体供试品项下方法操作。

b.同时应采用适宜的方法对包装中所配带的针头等要求无菌的部件进行无菌检查。

直接接种法● 直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品，即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇盐酸流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中。

● 除生物制品外，一般样品无菌检查时两种培养基接种的瓶或支数相等；生物制品无菌检查时硫乙醇盐酸流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基接种的瓶或支数为2：1。

●除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇盐酸流体培养基每管装量不少于15ml，胰酪大豆胨液体培养基每管装量不少于10ml，供试品检查时，培养基的用量和高度同方法适用性试验。

1）混悬液等非澄清水溶液体供试品 

取规定量，等量接种至各试管培养基中。

2）固体供试品  

取规定量，直接等量接种至各管培养基中，或加入适宜的溶剂溶解，或按标签说明复溶，取规定量等量接种至各管培养基中。

3）非水溶性供试品  

取规定量，混合，加入适量的聚山梨酯80或其他适宜的乳化剂及稀释剂使其乳化，等量接种至各管培养基中，或直接等量接种至含聚山梨酯80或其他适宜乳化剂的各管培养基中。

4）敷料供试品 

取规定数量，以无菌操作拆开每个包装，于不同部位剪取约10mg或1cm×3cm的供试品，等量接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。

5）肠线、缝合线等供试品

肠线、缝合线等及其他一次性使用的医用材料按规定量取最小包装，无菌拆开包装，等量接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。

6）灭菌医用器械供试品

除另有规定外，取规定量，必要时应将其拆散或切成小碎段，等量接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。

培养及观察

（1）将接种供试品后的培养基容器分别按各培养基规定的温度培养不少于14天。

（2）接种生物制品的硫乙醇酸盐流体培养基的容器应分成两等份，一份置30~35°C 培养，一份置20~25℃培养。

（3）培养期间应定期观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液不少于1ml 转种至同种新鲜培养基中，将原始培养物和新接种的培养基继续培养不少于4 天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。

结果判断

（1）若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定。

（2）若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。

（3）只有符合下列至少一个条件时可认为试验无效。

1) 无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。

2) 回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。

3) 在阴性对照中观察到微生物生长。

4) 供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。

（4）试验若经评估确认无效后，应重试。

（5）重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。下载本文