学生姓名：杨秀琼             学号：   20082401129           

专业：    化   学           年级班级：08化二                   

课程名称：仪器分析实验      实验项目：分子荧光法测定维生素B2的含量

实验类型：综   合           实验时间：2010/3/25               

实验指导老师 赖家平老师     实验评分：                      

分子荧光法定量测定维生素    B2含量

一、实验目的

1、学习荧光分析法的基本原理，了解荧光光度计的构造，掌握其基本操作。

     2、掌握标准曲线法测定分析维生素B2的含量

二、实验原理

1、维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：

维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。

2、某些物质经紫外光或波长较短的可见光照射后，会发射出波长更长的荧光。荧光光谱能反映物质的特性。 

对同一物质而言，在稀溶液 (即 A = abc <0.05 ) 中，荧光强度 F 与该物质的浓度 c 有以下关系

 (35.1)

式中 φf 为荧光过程的量子效率，a 为荧光分子的吸光系数，b 为试样的吸收光程，I0 为入射光的强度。当I0 及 b 不变时，上式为 F=Kc (35.2)式中 K 为常数。荧光法具有灵敏度高 (超过分光光度法 2~3 个数量级)，取样少，时间快等特点。

3、在 430~440 nm 蓝光照射下，维生素 B2 就会发生绿色荧光，荧光峰值波长为 535 nm。在 pH = 6~7 的溶液中其荧光最强，在 pH = 11 时其荧光消失。

三、仪器与试剂 

1.仪器 

930 型荧光光度计；容量瓶  50 毫升6个；吸量管  5毫升l支；

胶头吸管  小烧杯

2.试剂

维生素B2标准溶液，10.0微克/毫升：称取10.0毫克维生素B2，先溶解于少量的1%醋酸中，然后在l升容量瓶中，用1%醋酸稀释至刻度，摇匀。溶液应保存在棕色瓶中，置于阴凉处。

四、实验步骤

1.系列标准溶液的制备

取五个50毫升容量瓶，分别用吸量管准确加入1.00，2.00，3.00，4.00及5.00毫升维生素B2标准溶液，用蒸馏水水稀释至刻度，摇匀，待测。

2.待测样品溶液的制备

用吸量管准确吸取2.0ml未知试样溶液置于50毫升容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，待测。

3.激发光谱和荧光发射光谱的绘制

 分别设置发射波长为525nm,在250-400nm范围内扫描,记录发射强度和激发波长的关系曲线,便得到激发光谱.

从激发光谱图上可找到最大的激发波长为373nm

设置激发波长分别为250nm\\300nm 350nm 400nm 500nm 540nm 在400-600nm范围内扫描,记录发射强度与发射波长之间的函数关系,便得到荧光发射光谱,从荧光发射光谱上可以找到其最大荧光发射波长和荧光强度,比较不同激发波长下获得的最大荧光发射波长和荧光强度.

4.将激发波长固定在373nm,荧光发射波长为525nm,测量上述系列标准维生素B2溶液的荧光发射强度.以溶液的荧光发射强度为纵坐标,标准溶液浓度为横坐标,制作标准曲线.  

在同样条件下测定未知溶液的荧光强度,并由标准曲线测定未知试样中维生素B2的浓度,计算药片中的维生素B2的含量.

五、数据记录与结果分析

1、荧光激发光谱的绘制

得到最大的荧光激发波长Ex=373nm

2、发射光谱的绘制

从荧光发射光谱图上可找到最大的荧光发射波长为525nm

3、标准溶液及待测溶液的浓度和荧光强度记录如下:

维生素B2溶液浓度

待测溶液的浓度0.144  ug/

A、标准溶液浓度和荧光强度

B、标准曲线的绘制：

C、标准曲线的相关系数：

D、及待测溶液的浓度和荧光强

六、思考题 

1.在荧光测量时，为什么激发光的入射与荧光的接收不在一直线上，而呈一定角度？

由于激发光源照射作用下，试样基态原子受激发产生荧光，若成一直线，则会受到由于激发光源产生荧光的干扰，影响测定值。 

2、.干扰荧光分光分光度法的因素：

(1)溶剂：同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质。溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强度增大。

(2)温度：升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。

(3)PH：大多数含有酸性或碱性取代基团的芳香族化合物的荧光性质受PH的影响很大。

(4)溶液表面活性剂的存在，减少非辐射跃迁的概率，提高了荧光效率。

(5)溶液中溶解氧的存在，由于氧分子的顺磁性质，使激发单重态分子向三重态的体系间窜跃速率加大，因而会使荧光效率降低。

3．维生素B2在pH＝6～7时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？

原因：维生素B2在碱性溶液中经光线照射，会发生分解而转化为光黄素，后者的荧光比核黄素的荧光强的多。因此，测量时溶液要控制在酸性范围内，且必须在避光条件下进行。下载本文