谢佳胤;李捍东;王平;李霁
【摘 要】微生物传感器是一种以微生物活细胞或细胞碎片作为敏感元件,结合电化学换能器,对被分析物具有高度选择性的装置,具有灵敏度高、检测速度快、操作简便、成本低、可进行连续动态监测等优点.在介绍微生物传感器的结构、工作原理及分类的基础上,对其在生物工业、环境监测和临床医学等领域中的应用研究进行综述,并探讨了微生物传感器的发展前景.
【期刊名称】《现代农业科技》
【年(卷),期】2010(000)006
【总页数】4页(P11-13,15)
【关键词】微生物传感器;生物工业;环境监测;临床医学
【作 者】谢佳胤;李捍东;王平;李霁
【作者单位】中南林业科技大学生命科学与技术学院,湖南长沙,410004;中国环境科学研究院;中国环境科学研究院;中南林业科技大学生命科学与技术学院,湖南长沙,410004;中国环境科学研究院
【正文语种】中 文
【中图分类】X859
生物传感器是一个典型的多学科交叉产物，结合了生命科学、分析化学、物理学和信息科学及其相关技术，能够对所需要检测的物质进行快速分析和追踪[1-4]。根据分子识别元件的不同，可将其分成7类[5-7]：酶传感器、微生物传感器、免疫传感器、组织传感器、细胞传感器、核酸传感器、分子印迹生物传感器。
随着微生物固定化技术的发展，微生物传感器的研究和应用取得很大的进展。微生物传感器以微生物活体作为识别元件，特别适用于需复酶和辅酶再生系统参与的生物反应测定，在生化需氧量和生物毒性等综合指标的监测上表现出独特优势[8-11]。微生物传感器分析周期短，操作简便，自动化程度高，具有较高的精密度和准确度，节省了人力、物力，提高了工作效率，能广泛应用于地表水、生活污水及部分工业废水的测定[12]。微生物传感器现已应用于生物工业、环境监测、临床医学等领域，具有广泛的发展前景。
1 微生物传感器的结构
微生物传感器是使用微生物活细胞或细胞碎片作为敏感元件与电化学换能器来制备生物传感器[13-14]。主要由2部分组成[15-16]：第1部分是微生物膜，此膜是由微生物与基质（如PVA，海藻酸钠等）以一定的方式固化形成；第2部分是信号转换器（如O2电极、气敏电极或离子选择电极等）。
2 微生物传感器的工作原理及分类
微生物在利用物质进行呼吸或代谢的过程中，将消耗溶液中的溶解氧或产生一些电活性物质。在微生物数量和活性保持不变的情况下，其所消耗的溶解氧量或所产生的电活性物质的量反映了被检测物质的量，再借助气体敏感膜电极（如溶解氧电极、氨电极、二氧化碳电极、硫化氢电极）或离子选择电极（如pH玻璃电极）以及微生物燃料电池检测溶解氧和电活性物质的变化，就可求得待测物质的量，这是微生物传感器的一般原理。
微生物电极的种类很多，根据微生物与底物作用原理的不同，微生物电极可分为测定呼吸活性型微生物电极、测定代谢物质型微生物电极。根据测量信号的不同，可分为电流型微生物电极、电位型微生物电极[17]。
3 微生物传感器的应用
3.1 在生物工业中的应用
生物工业泛指利用生物系统或生物材料加工生产的过程，如发酵工程、酶工程、细胞培养工程、食品工程等。
Hikuma等[18]于1979年用固定化毛孢子菌制成的醇电极实现了对发酵罐中醇的测定，之后又于1980年利用固定化大肠杆菌制成的谷氨酸电极对发酵罐中谷氨酸的含量进行测定，得到令人满意的结果。Karube[19]在1979年首先使用P.fluorescens菌株制成了葡萄糖传感器，Mascini[20]于1986年使用S.cerevisiae菌株制成另一支葡萄糖传感器，二者均可检测发酵液中葡萄糖的含量，后者实现了离线监测。
19年，张先恩等[21]将酿酒酵母菌固定在氧电极表面，用于蔗糖等低分子糖的测定，用动态法和稳态法测定糖的浓度有不同的线性响应，动态法响应范围高至100 mg/L，稳态法仅达75 mg/L，这种差异可归处于细胞与环境的综合效应，与测试搅拌速度、外部溶液的供氧能力、底物在传感器界面和细胞内的传质速率等因素有关。该微生物电极用于以蔗糖为唯一碳源的类胡罗卜素微生物发酵过程的监测，样品需要量50 μL，测定结果显示醪液中蔗糖消耗与生物量增长有明显的异向同步性。值得注意的是，微生物电极测定葡萄糖的浓度时，检出下限为10-5mol/L，而用酶电极为10-4 mol/L，可见微生物电极灵敏度较相应的酶电极的高。
1990年，Surareungchai等[22]报道了一种新的测乙醇微生物电极，这种电极有2个特征：对乙酸及其他醇类不响应（表1）和在pH值为2~10的范围内均能稳定工作。
表1 纹膜醋酸杆菌微生物电极对各种化合物的响应?
2002年，Tkac J等[23]将一种以铁氰化物为媒介的葡萄糖氧化酶细胞生物传感器用于测量发酵工业中的乙醇含量，13 s内可以完成测量。
3.2 在环境监测中的应用
微生物传感器是生物传感器研究中的一个热点，它是将活细胞作为探测单元，利用微生物的新陈代谢机能进行污染物的检测和分析。微生物传感器具有反应速度快、便于连续化和自动化控制、易于管理等优点，广泛应用于检测环境中的农药残留物（表2）、氯苯甲酸盐类物质、苯类物质、氰化物、多氯联苯和有毒重金属等[24-25]。
表2 微生物传感器检测农药残留的实例?
1977年，Karube首次将土壤中微生物用骨胶原膜固定在氧电极上测定污水的生化耗氧量（bio-chemical oxygen demand，BOD）。目前，国内外已研制和应用于环境监测的微生物传感器有10多种，已见报道的有水质监测的BOD传感器、盐微生物传感器、酚类物质及阴离子表面活性剂传感器和水体富营养化监测传感器以及有利于大气和废气监测的亚硫酸、亚盐、氨、甲烷及CO2微生物传感器等[29]。
Han等发明了一种新型微生物传感器，可用于测定三氯乙烯。该传感器将假单细胞菌JI104固定在聚四氟乙烯薄膜上，再将薄膜固定在氯离子电极上。带有AgCl/Ag2S薄膜的氯离子电极和Ag/AgCl参比电极连接到离子计上，记录电压的变化，与标准曲线对照，测出三氯乙烯的浓度。该传感器线性浓度范围为0.10~4.00 mg/L，是用于检测工业废水，在最优化条件下，其响应时间不到10 min。Shikha R等[30]采用一种新的固定微生物膜的方法，在4℃下把微生物膜存储在50 mmol/L、pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液中，传感器可保持180 d的稳定性；在反应特征信号无明显降低的前提下，被固定的微生物膜可以重复使用200次；最低检测限为1 g/L BOD该传感器在5～10 min内对于含有高、中、低浓度并且可生物降解的有机物质的工业废水可进行准确的评估。田中良春等人将硝化细菌固定化菌膜固定在溶解氧电极上组成传感器，以KCN为毒性参照物，通过监测硝化细菌的呼吸速率的变化来测定有毒物质的毒性，响应时间能达到20 min，最低检出限为0.05 mg/L，微生物膜能够稳定使用1个月[31]。严珍用普通滤纸作菌膜组装的发光细菌生物传感器可用于海洋水质监测和蔬菜农药残留的检测，选择脱脂牛奶作为保护剂，采用冷冻干燥并真空包装的方法，使菌膜在一定程度上隔绝水分和氧气而不会过分生长，便于野外或携带至船上进行实时监测，菌膜的使用寿命能达到1个月，与标准的发光细菌毒性试验相比，具有操作简单、重现性好、易于携带等优点[32]。
目前，微生物传感器的研究主要集中在利用基因工程的方法和技术，把含有lux或lac操纵子的重组子转移到受体细胞中，受体细胞表达荧光索蛋白或其他信号报告系统如碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶等，用以对特殊污染物进行检测。
在特殊污染物检测和污染物分类方面，用产GFP的假单胞菌（Pseudomonas sp.）检测甲苯和相关化合物的传感器已有报道。用基因工程的Sphingomonas sp.检测芴和它的降解产物、用GFP报告基因检测亚砷盐和砷盐、相似的技术检测生物胺、用2种不同菌样研究汞和其他重金属的毒性效应等均有报道。Shao C等[33]用蓝细菌（cyanobacteria）制成的生物发光传感器检测除草剂。Mirasoli M等[34]通过引入额外的报告基因研制了一种运用分析反应内在修正机制的细菌传感器。Christoph W等[35]将携带luxAB基因的NAH7质粒导入恶臭假单胞菌（Pscudomonas putida）中，制成生物传感器检测空气中的有机污染物，对萘的检测浓度达到0.5 μmol/L。Michael N等[36]筛选出2种微生物用于传感器研究，检测水中NO2-的灵敏度可达1 μmol/L，而且90%的反应在3 min以内完成，完全可以用于废水中NO2-的监测。
许多研究者报道了不产生发光信号的基因工程微生物，其中lacZ使用最多。基于呼吸检测的微生物和植物细胞传感器已用于特殊废水分析。最近，表面显示技术已用于微生物传感器，在细胞外膜引进新的表面蛋白，造成细胞表面新的结合或催化功能，而对细胞无害。
微生物传感器可以定性、定量测量被分析物质的信息，即确定某类物质存在与否及浓度大小。以活细胞为感受器发挥了微生物特别是部分耐极端环境微生物的长处，重复使用率高，在一定程度上降低了成本。基因工程技术的引入使得敏感元件分子与耐受菌株、信号传递能够完美结合。更重要的是，微生物传感器能够测量功能性信息，即监测被分析物对活细胞生理功能的影响，从而解决一些与功能性信息相关的问题。因此，微生物传感器未来仍然是环境监测中生物传感器的主力。但其缺点也较为明显，活细胞必然带来许多不确定因素，这就需要不断对微生物的生理和遗传做深入研究。
3.3 在临床医学中的应用
在医学领域，许春向[37]首次运用半微分循环伏安法进行了人白血病白细胞和健康人白细胞的识别工作，取得了令人满意的结果。着眼于致癌物质对遗传因子的变异诱发性，人们利用微生物传感器对致癌物质进行一次性筛选。在临床检验中[38]，Vincke等于1983年利用变形杆菌制成了尿素传感器。同年，Kabo等制成了用于测定血中肌酸肝含量的微生物传感器。血糖传感器和尿酸传感器使糖尿病和痛风患者能在家中对病情进行自我监测[39]。
4 微生物传感器的优点和不足
以微生物活细胞来设计生物传感器，其实就是调动微生物细胞的整个系统来对外源物质进行响应，其优点在于：获取微生物细胞比较容易；微生物细胞是极为丰富的酶源，而且细胞膜系统本身就是最适宜的酶活动的载体，通过特定方法维持细胞活性，可以保持长时间的酶活性；由于调动整个细胞或部分酶体系参与反应，催化过程有可能在细胞内循环，信号得以放大，因此，微生物电极的灵敏度比相应的酶电极的高。但又由于微生物细胞的复杂性，致使微生物电极也存在一些先天不足：一是多酶体系的存在，有可能对复杂样品产生非特异性响应。二是维持细胞活性是一个精细的过程，然而常常由于缺乏足够的经验而导致细胞过早的死亡，微生物传感器的工作寿命因而受到影响。三是以全细胞为敏感元件的微生物电极，测定受到多种因素的影响，如细胞的通透性、酶的诱导活性、细胞内相关酶的活性状态等，因而微生物电极测定的精度和重复性一般比酶电极的要差。四是微生物固定化方法也需要进一步完善，首先，要尽可能保证细胞的活性；其次，细胞与基础膜结合要牢固，以避免细胞的流失；另外，微生物膜的长期保存问题也有待进一步的改进，否则难以实现大规模的商品化。五是生物响应稳定性和微型化便携式等问题。仪器小型化将降低样品体积、试剂消耗和生产费用。
5 结语
如果能够充分利用上述优点并克服或避免其缺陷，则微生物传感器能够发挥重要作用。在这方面，前日本东京大学先导科学研究所的Iso Karube研究组最为活跃。美国的Harold H.We等指出，生物传感器商品化要具备以下条件：足够的敏感性和准确性、易操作、价格便宜、易于批量生产、生产过程中进行质量监测。其中，价格便宜决定了传感器在市场上有无竞争力。而在各种生物传感器中，微生物传感器最大的优点就是成本低、操作简便、设备简单，因此其在市场上的前景是十分巨大和诱人的。
微生物传感器现已在各领域得到应用，其检测能力已被广泛认识，但很多传感器目前仍处于研究阶段，测定对象中的毒害因素如重金属和有毒有机物是影响微生物传感器稳定响应和寿命的关键因素，也是微生物传感器市场化的主要控制因素。因此，开发新的固定化技术，利用微生物育种、基因工程和细胞融合技术研制出新型、高效耐毒性的微生物传感器是该领域科研人员面临的课题。相信微生物传感器作为一个具有发展潜力的研究方向，定会随着生物技术、材料科学、微电子技术等的发展取得更大的进步，并逐步趋向微型化、集成化、智能化。
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