范围：本规程适用于细菌内毒素检查。

职责：生物检测人员对本规程实施负责。

内容：

1  准备工作

1.1 设备用具的洗涤及除热原

1.1.1  设备与用具

刻度吸管(1、2、5、10ml)、10mm×75mm试管、试管架、不锈钢盒(或铝饭盒)、不锈钢筒(或铝筒)、洗耳球、电热干燥箱、恒温水浴箱、定时钟、电冰箱、旋涡混合器。

1.1.2  洗涤及除热原

所用的玻璃器皿，先用自来水冲洗，再浸泡在洗液中过夜，取出后用自来水冲洗至pH中性，再用注射用水冲洗三次。将刻度吸管放入金属筒内，试管、小瓶等放入金属盒内，于250℃干烤至少60分钟，也可采用其其它确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。

1.2  试剂与标准品

1.2.1  内毒素检查用水(即无热原水)，为内毒素含量不超过0.015Eu/mL的灭菌注射用水。

1.2.2  75%酒精棉。

1.2.3  细菌内毒素工作标准品，系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。由中国药品生物制品检定所标定和供应。

1.2.4  供试品溶液的制备：

某些供试品需进行复溶，稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH值在6.0—8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家的推荐的适宜的缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。

内毒素限值的确定：

药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：

        L=K/M

式中：L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；

K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg·h)表示，注射剂K=5EU/(kg·h)，放射性药品注射剂K=2.5EU/( kg·h)，鞘内用注射剂K=0.2EU/( kg·h)；

M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kg·h)、mg/( kg·h)或U( kg·h)表示，人均体重按60Kg计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。

按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。

确定最大有效稀释倍数（MVD）    最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD：

MVD=c·l/λ

式中 L为供试品的细菌内毒素限值；

     C为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml 表示时，则c等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L；

     λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。

 1.2.6  鲎试剂，应具有国家主管部门的批准文号。为冻干品，规格有0.1ml/支和0.5ml/支两种。

在使用新一批的鲎试剂前，必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。

药典中已有规定的品种或有其他内毒素检验标准的品种，可直接进行内毒素检查，如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰实验的验证；其他未建立内毒素检查的品种需先进行干扰实验，确定不干扰浓度后再进行内毒素检查。

细菌内毒素检查过程中的阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则实验结果无效。

2.供试品测定

按下表制备溶液A、B、C和D。使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。

溶液的制备

根据鲎试剂灵敏度的标示量（λ），将细菌内毒素国家标准品或用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后按上表制备供试品阳性对照与阳性对照，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取鲎试剂复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿8支，其中4支中2支分别加入0.1ml 2λ的内毒素标准溶液与2支0.1ml2λ的供试品溶液，另外4支中2支管加入0.1ml细菌内毒素检查用水与2支0.1ml的供试品溶液。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。

将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。

结果判断

若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平等管均为阳性，试验有效。若溶液A的两个平行管均为阴性，判供试品符合规定；若溶液A的两个平行管均为阳性判为供试品不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。

复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判供试品符合规定；否则判供试品不符合规定。

3.相关的文件记录：

《鲎试剂灵敏度复检记录》REC-ZL-28-####

《细菌内毒素检查记录》REC-ZL-29-####下载本文