2、在文件开始处增加“主文件”和“文件变更说明及内容”。

建立微生物限度检查的操作规程，为微生物检查人员提供正确的标准操作方法。

2  范围

适用于原辅材料、内包装材料、半成品、成品的微生物限度检查。

3  责任

   QA对本规程的有效执行承担监督检查责任，QC对本规程的实施负责。

4  程序

4.1 简述: 微生物限度检查法系指检查非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。螨，属于节肢动物门，蛛形纲，蜱螨目。种类繁多，分布甚广。其生活习性各异，分为自由生活和寄生生活两种类型。在土壤、池沼、江河和湖海里，动、植物体上，贮藏食品和药品中，都可能有它们的存在。药品可因其原料、生产过程或包装、运输、贮存、销售等条件不良，受到螨的污染。螨可蛀蚀损坏药品，使药品变质失效，并可直接危害人体健康或传播疾病。能引起皮炎及消化系统、泌尿系统、呼吸系统等的疾病。因此，药品特别是中成药，必须进行活螨检查。

4.2 器皿、仪器及用具。

4.2.1 玻璃器皿：

250ml锥形瓶、250ml具塞三角烧瓶、研钵（陶瓷制，直径10-12cm）、培养皿（90mm）、量筒（100ml）、试管（18×180mm）及塞、吸管（1ml分度0.01,10ml分度0.1）、注射器(20或30ml)、注射针头、载玻片、盖玻片、

玻璃消毒缸（带盖）。

4.2.2 用具：大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用70%-75%乙醇溶液浸泡）,无菌衣、帽、口罩、手套灭菌，备用, 显微镜、放大镜（5-10倍）、实体显微镜、解剖针（尖端宜尖细且粗糙，否则不易挑取体表光滑的螨体）、发丝针（由一根长约10cm的小金属棒，将其一端磨成细尖，另取长约1.5cm的头发一根，以其长度的一半紧贴在金属棒的尖端上，用细线将其缠紧，然后粘上加拿大树胶或油漆，即得。适用于挑取行走缓慢且体表刚毛较多的螨体）、小毛笔（即绘图毛笔。适用于挑取活动快的螨类，笔锋宜尖细，以免螨体夹在笔毛之间）、载玻片、盖玻片、酒精灯、培养皿或小搪瓷盘（内衬黑色纸片）、扁形称量瓶（高3cm、宽6cm）。

4.2.3 仪器：匀浆仪、培养箱、鼓风干燥箱、台式灭菌器、恒温水浴锅、超净工作台、菌落计数器、微波炉等。

4.3 培养基及试液：

营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、蛋白胨水培养基、磷酸盐葡萄糖胨水培养基、枸橼酸盐培养基、伊红美兰琼脂培养基；靛基质试液、甲基红指示液、а-萘酚乙醇试液、30%甘油溶液，PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。

4.4 供试品抽样、保存及检验量；

4.4.1 抽样：

4.4.1.1 一般采用随机抽样方法，抽样量应为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量（以备复试）。

4.4.1.2 抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品，但机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。

4.4.1.3 凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格品，无需再抽样检验。

4.4.2 保存

4.4.2.1 供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件不妥引起致死，损伤或繁殖。

4.4.2.2 供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品。

4.4.3 检验量

4.4.3.1 所有剂型的检验量均需取2个以上最小包装单位。

4.4.3.2 固体及半固体（粘稠性供试品）制剂检验量为10g。

4.5 操作方法：

4.5.1 试验前准备

4.5.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆罐、试管、吸管（1ml、10ml）、量筒、稀释剂等移至无菌室内。每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。

4.5.1.2 开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作时间不低于30min。

4.5.1.3 操作人员用洗手液洗手，关闭紫外杀菌灯及空气过滤装置，打开鼓风机。进入一更，更换工作服，二更穿戴工作服、口罩，进入缓冲间。再用0.1%新洁尔灭或用75%乙醇进行手消毒后，进入操作间。

4.5.1.4 操作前先用75%乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用75%乙醇棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。

4.5.2 供试液的制备

4.5.2.1 固体、半固体或粘稠供试品称取供试品10g，置匀浆罐或具塞三角瓶中，加PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜方法分散混匀。作为1：10的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。

4.5.2.2 供试液的稀释

取均匀供试液，进一步稀释成1：102、1：103等适宜的稀释级。分别取连续三级10倍稀释的供试液各1ml，置直径约90mm的平皿中，再注入约45℃的培养基约15ml～20ml，混匀，待凝固后，倒置培养，每稀释级应作2-3个平皿。

4.5.3 检查法：

4.5.3.1 细菌、霉菌与酵母菌计数。

A 培养：

a 营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌、酵母菌计数。

b 菌数测定阴性对照试验  取供试验用的稀释剂各1ml，置2个无菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板，培养，检查，不得长菌。

c 除另有规定外，细菌培养3天，霉菌、酵母培养5天, 逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板，不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试品溶液的平均菌落数，按菌数报告规定报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差一倍或以上。

B 菌数报告规则

a  细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300cfu、霉菌宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告1g、1ml或10cm2供试品中所含菌数。如各稀释级的平板无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以＜1乘以最低稀释级倍数的值报告菌数。                          

4.5.3.2 控制菌检查

a大肠埃希菌检查法

取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2），直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养18-24小时，必要时可延长至48小时。

取上述培养物0.2ml,接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外光下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。

如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性，靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性，靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18-24小时。

若平板上无菌落生长或生长的菌落与表1所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与表1所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的鉴定试验，确认是否为大肠埃希菌。

表1大肠埃希菌菌落形态特征

胆盐乳糖发酵管若无菌生长或有菌生长但不产酸产气，判该管未检出大肠菌群；若产酸产气，应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。

若平板上无菌落生长，或生长的菌落数与表2所列的菌落形态特征不符合或为非革兰阴性无芽孢杆菌，判该管未检出大肠菌群；若平板上生长的菌落形态特征与表2所列的菌落形态特征相符或疑似，且为革兰阴性无芽孢杆菌，应进行确证试验。

   表2大肠菌群菌落形态特征

  根据大肠菌群的检出灌输，按表3报告1g或1ml供试品中的大肠菌群数。

表3  可能的大肠菌群数表

4.5.3.3活螨检查

A 螨的形态特征：螨的体形微小，多在1mm以下。一般呈卵形或椭圆形，无头胸腹界限。幼螨足三对，成螨足多数为四对。足通常由六节组成。口器向前端突出，螯肢常呈螯钳状，有齿，由2-3节组成。须枝节数因种类而异，由1-2节到5节组成。有些种类在躯体前端或两侧有1-2对眼。躯体两侧对称，表面被有坚硬的几丁质的板。体表有刚毛，它的形状、数目及彼此间长短比例和排列位置因种类而异。螨与蜘蛛、昆虫（如书虱）相比，其外形比较近似，因此，必须注意它们之间的主要区别（

见表4）。

B 活螨的一般检查方法：

a 直检法：取供试品先用肉眼观察，有无疑似活螨的白点或其他颜色的点状物，再用5-10倍放大镜或实体显微镜检视。有螨者，用解剖针或发丝针或小毛笔挑取活螨放在滴有一滴甘油溶液的载玻片上，置显微镜

下观察。

表4     螨与蜘蛛、昆虫主要形态鉴别表

c 分离法：也称烤螨法。取供试品放在附有孔径大小适宜的筛网的普通玻璃漏斗里，利用活螨避光、怕热的习性，在漏斗的广口上面放一个60-100W的灯泡，距离药品约6cm处，照射1-2h。活螨可沿着漏斗内的底部细颈内壁向下爬，用小烧杯装半杯甘油溶液，放在漏斗的下口处，收集爬出的活螨。

在上述三种方法中，以前两种方法操作简便、效果好、检出率高，固多采用。而后一种方法操作较繁琐、费时、效率低，较少采用。

C 药品的活螨检查方法:

a 供试品取样量，每批抽取两盒,每盒检查3-4个最小包装单位。必要时，可再次抽样，或选取有疑问的样品进行检查。

b 胶囊剂  先直接检查药瓶内盖及塑料薄膜袋的内侧有无活螨。后将药品放在衬有洁净黑纸的培养皿或搪瓷盘里，使成薄层，直接检查。必要时可再用漂浮法检查。并注意检查药瓶口内壁是否有螨。

D 注意事项：

a 螨在春夏和秋冬相交季节，繁殖旺盛，爬行活跃，易于检出，在寒冬

时则活动微弱甚至不动。鉴别时，可在灯光下检查，光和热的刺激促使其活动，利于检查。

b 活螨多为略带白色，晶亮的囊状小体，以暗色背景相衬，十分明显，故检查时一定要注意与背景的反差，白色的背景常常掩盖螨的发现。

c 漂浮法检螨用的称量瓶，以高3cm，口径6cm为宜，由于液面较宽，便于

直接用放大镜或实体显微镜检查。用载玻片沾取检样时，接触面积大，检出率高,亦可用其他适当容器代替。

d 每次检查后的供试品、器皿和用具，特别是阳性供试品，应即时用焚烧、加热等法处理，杀灭活螨、以免污染操作环境及人体。

e 为保留阳性结果备查，可将检出的活螨制成临时观察标本和长期保存标本。

f 临时观察标本：挑取检出的活螨，放在预先滴有1滴75%乳酸溶液的载玻片上，加盖玻片，置于酒精灯小火焰上，来回移动，缓缓加热片刻，使其适当透化，即可镜检。鉴定后的螨体，亦可放入50-70%的乙醇溶液中保存，或作适当处理。

4.6 结果判断

4.6.1 细菌菌落数、霉菌（酵母菌）菌落数、控制菌三项均符合该品种微生物限度项下规定，应判供试品合格；其中任何一项不符合该品种项下规定，应判供试品不合格。

4.6.2 细菌菌落数、霉菌（酵母菌）菌落数第一次测定超过该品种微生物限度项下规定时，应从同一批号样品中随机抽样，复试2次，以3次结果平均结果值报告。

4.6.3 眼科用药的霉菌和酵母菌菌落数复试报告，须以2次复试结果均不得长菌，方可判供试品合格。

4.6.4 如营养琼脂培养基平板生长霉菌（酵母菌）菌落数或玫瑰钠琼脂培养基平板生长细菌菌落数超过该品种微生物限度项下规定时，经复试2次，如3次结果平均值仍超过规定，应判供试品不合格。

4.6.5 各类制剂检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再抽样复试，即判该供试品不合格。   

4.6.6 凡供试品按上述规定检查，发现活螨者，作检出活螨报告。下载本文