1. 试剂与仪器：

1.1 试剂

PBS磷酸缓冲液：Solarbio，货号：P1022

胰蛋白酶-EDTA溶液：Gibco公司，货号15400054 100 mL；

青链霉素：Gibco公司，货号15140-112 100 mL；

FBS：Gibco公司，货号 10091-148 500 mL；

DMEM （4.5g/L glucose）培养基：CORNING公司，货号 10-013-CVR 500 mL；

RPMI 10 ：CORNING公司，货号10-040-CVR 500mL；

DMSO：SIGMA公司，货号：D8418；

PBS磷酸缓冲液：Solarbio，货号：P1022

1.2 仪器

生物安全柜：

离心机：

 37℃恒温水浴箱：

-80℃冰箱： 

4℃冰箱： 

荧光倒置显微镜：

37℃恒温培养箱： 

液氮罐： 

2、实验方法：

2.1 细胞冻存

配制含10% 体积DMSO的冻存培养液（90% FBS+10% DMSO或70%培养基+20%FBS+10%DMSO），冻存盒室温放置。

将正常生长的贴壁细胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA（6 cm皿加入1 mL，10 cm皿或T25细胞瓶加入2 mL），37℃放置直至细胞显微镜下缩成圆球状，加入消化液体积2倍以上培养基，终止消化，将细胞吸取至15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入适量冻存液重悬细胞，1mL分装于冻存管中，做好标记。

悬浮细胞收集细胞培养液于15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入适量冻存液重悬，1 mL分装于冻存管中，做好标记。

将冻存管放入冻存盒中，放入-80℃过夜，第二天转入液氮中长期保存。

2.2 细胞复苏

    从液氮罐中取出冻存管，快速浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；从37℃水浴中取出冻存管，在安全柜中，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到15 mL离心管中（15 mL 离心管中已事先加入4 mL培养基）混匀，800 rpm，离心5 min，弃去上清液，加入含10%血清的培养液重悬细胞，根据离心后的细胞沉淀，将细胞培养在10 cm 皿或6 cm皿的培养皿中（一般选用6 cm皿） 37℃培养箱静置培养。次日更换1次培养液，继续培养。

2.3 细胞传代

状态良好的贴壁细胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA（6cm皿加入1 mL，10 cm皿或T25细胞瓶加入2 mL），37℃放置直至细胞显微镜下缩成圆球状，加入胰酶体积2倍以上培养基，终止消化，将细胞吸取至15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入1-2ml培养基重悬细胞，吹打均匀后根据细胞生长速度1瓶传2瓶或1瓶传3瓶，补齐培养基（6cm皿加5ml，10cm皿加10ml）后放入37℃培养箱继续培养。

悬浮细胞在显微镜下观察，健康的细胞干净而透明，核清晰可见，静置培养时常见小细胞团。

①若细胞状态好，培养基干净而无明显颗粒物沉淀，可直接1:2或1:3分瓶传代培养。

②若细胞有碎片，培养基中颗粒物多，则需收集细胞培养液于15ml离心管中，600rpm离心5min，去上清，加入适量完全培养基重悬，轻柔吹打混匀后，根据细胞生长速度，1:2或1:3传代培养。

3、注意事项

1）细胞一旦染菌后直接舍弃并检查所有试剂耗材是否污染，如细胞样本非常珍贵可考虑按下列操作抢救挽回，抢救过程染菌风险极高千万要小心谨慎。

及时换掉已受污染的培养基，PBS清洗7-8次，洗至显微镜下观察看不到一颗细菌为宜，清洗后用高浓度双抗（20×）浸泡5分钟，PBS清洗两次，用含2×双抗的完全培养基另外添加抗支原体药和庆大霉素进行培养；

2）细胞消化过程需紧密观察细胞状态，避免消化过度导致细胞死亡，消化时间在1-10分钟不等。

3）细胞冻存密度一般控制在1×106个/ml，可按实验需要进行调整，尽量不要低于1×105个/ml，防止因细胞过于稀疏而导致的复苏失败。

4）细胞培养过程中如发现因细胞状态不佳导致的培养基底部出现黑点杂质，可将细胞消化下来后用PBS重悬，低转速（500rpm，3min）离心，重复两次。

细胞迁移操作流程

1、实验原理：

将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。Transwell迁移实验常用8.0、12.0 µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。

2、实验材料与仪器：

2.1试剂

PBS磷酸缓冲液

培养基： 

胰酶；

FBS：

Transwell板（24孔板，孔径8um）： Corning Incorporated公司。

0.1%结晶紫：SIGMA公司。

4%多聚甲醛：SIGMA公司。

2.2 仪器

 台式低速离心机：

 二氧化碳培养箱：

 细胞培养皿：Thermo公司；

 倒置显微镜：

 生物安全柜：

3、实验方法：

3.1 实验流程

3.2 实验步骤

（1）消化收集细胞，1000rpm离心5min；   

（2）用1×PBS清洗一次，用对应空白培养基重悬细胞，计数，调整细胞密度为1×105-1×106个/ml；

（3）选择孔径大小为8.0μm的transwell板，上室加入100μL细胞悬液，下室加600μL含血清的培养基作为趋化因子，37°C、5%CO2孵育；

（4）24-48h（最迟不超过48h）后取出小室，用1×PBS清洗三次；

（5）用4%多聚甲醛固定30min，用1×PBS清洗三次；

（6）0.1%结晶紫染色30min，用1×PBS清洗三次，使用棉签去除滤膜表面未穿膜细胞；

（7）拍照（200×）计数。

4、注意事项

1）每个细胞迁移能力不同，本实验需先做预实验摸清铺入的细胞密度，大部分肿瘤细胞可发生迁移的细胞数目在2-8万个/孔。

2）用棉签擦除滤膜表面未穿膜细胞时动作一定要轻柔，滤膜本身柔软易变形，一旦用力过大导致滤膜变形，后续显微镜拍照时便无法细胞将聚焦在同一平面内，导致实验失败。

细胞划痕操作流程

1、实验原理

 细胞划痕实验（Wound Healing)是一种操作简单，经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外试验方法。这种方法的原理是，当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。基本的步骤包括“划痕”的制造，细胞迁移期间图像的获得以及后期数据的处理。

2、实验材料与仪器：

2.1试剂

培养基：Corning公司；

双抗（青霉素、链霉素）：Gibco 公司；

胰酶：0.5%Trypsin-EDTA，Gibco公司；

记号笔

直尺

2.2 仪器

生物安全柜：

离心机：

倒置显微镜： 

37℃恒温培养箱：

3、实验方法：

3.1 实验流程

3.2 实验步骤

（1）先用记号笔在6孔板背面，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过4条线；

（2）取生长对数期细胞消化计数铺六孔板，贴壁过夜，控制第二天细胞密度达100%；

（3）第二天用10μl或200μl头比着6孔板盖，尽量垂至于背后的横线划痕，头要垂直，不能倾斜；

（4）用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基；

（5）一般按0、24、48、72h取样，在显微镜下拍照，并且保证在不同时间点下，拍下相同视野的照片。

4、 注意事项

1）划痕前不需要吸干培养基，划痕结束后再吸掉培养基加PBS清洗后加无血清培养基；

2）划痕的距离不宜太宽，以免不能在显微镜视野下呈现；

3） 若划痕实验过程中需药物作用，其药物浓度需在无血清条件下进行摸索。

4） 若在相应时间点拍照时发现漂浮的细胞过多，此时需更换培养基，洗干净漂浮的细胞后再继续拍照。

5） 划痕法一般只能用于上皮，纤维样细胞系。因为

a.这些细胞本身有迁移能力，且较强。

b.细胞有极性，方便测量，观察。

c.细胞对无血清有较强的忍受力（至少24小时），因此很多肿瘤细胞系是不适合做划痕的，很多肿瘤细胞系在无血清培养下，12小时细胞凋亡就超过50%。而一些上皮样细胞系甚至可以忍受高达72小时的无血清实验。

克隆形成实验操作流程

1、实验原理：

    克隆形成实验是肿瘤细胞学研究中的一种常用技术，其原理是将细胞分离成单细胞悬液，在培养基上接种培养，根据集落形成数量和大小来检测细胞增殖能力和致瘤性。该实验可用来研究肿瘤细胞的增殖能力、侵袭性，探讨细胞对不同杀伤因素的敏感性。

   根据培养基是否需要软琼脂，克隆形成实验可以分为平板克隆形成实验（PCF）和软琼脂克隆形成实验（SACF）。PCF是直接将细胞接种于培养瓶、培养皿中，优点为操作简便、细胞间分泌的促生长因子可在培养液中扩散、克隆形成率高，适用于贴壁生长的细胞; 缺点为细胞在 贴壁前易于移动。SACF 是采用半固体培养基模拟体内生长环境，适用于悬浮细胞及不依赖于贴壁生长的肿瘤细胞。在悬浮状态下不能增殖的细胞（如正常成纤维细胞）不适用此法。

2、实验材料与仪器：

2.1试剂

培养基：Corning公司；

双抗（青霉素、链霉素）：Gibco 公司；

胰酶：0.5%Trypsin-EDTA，Gibco公司。

2.2 仪器

生物安全柜： 

离心机： 

倒置显微镜： 

37℃恒温培养箱： 

3、实验方法：

3.1 实验流程

3.2 实验步骤

（1）适用细胞：贴壁细胞

（2）将目的细胞的培养基吸弃，用1×PBS润洗2遍去除残余的培养基，加入胰酶消化细胞（最好将细胞消化成单个细胞或者后续吹打细胞使其成单个细胞状态）。细胞离心弃去上清，用适量培养基重悬，使用细胞计数板计数，根据计数结果将细胞密度稀释（最好梯度稀释）成合适的密度（如10000个/ml）；

（3）细胞铺板：若要观察正常细胞的克隆形成情况，建议按六孔板每孔300-500个铺板，14-20天后结束培养；若要看药物处理或辐射等处理的细胞集落形成情况，建议做个预实验，六孔板分别铺500，2000，4000，8000，个/孔，14-20天后结束培养，找出最适的密度，然后再进行后续的实验；

（4）14-20天后，细胞停止培养，吸去培养基，用1XPBS洗3遍，然后用4%PFA固定液固定30分钟，1XPBS洗3遍，然后加入0.1%结晶紫染色30分钟，再用1XPBS洗3遍至五紫色背景，最后在镜下数细胞集落数。

4、 注意事项

1）细胞培养过程较长前期3-4天换一次培养基，后期2-3天换一次培养基，可观察培养基颜色来保证细胞营养充足。

2）细胞停止培养前先在显微镜下观察其形成集落情况，以看到大部分集落由50个以上单个细胞组成为宜。

3）用PBS清洗结晶紫染液时应尽快吸掉,不可在PBS中浸泡时间过长，以免褪色。

细胞凋亡检测操作流程

1、实验原理：

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。

    碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

2、实验材料与仪器：

2.1试剂

Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection kits ：联科生物

流式胰酶：Gibco 公司，

流式管。

2.2 仪器

流式细胞仪：

3、实验方法：

3.1 实验流程

3.2 不带GFP荧光细胞凋亡实验步骤（Annexin V-FITC/PI）

（1）收集细胞：①贴壁细胞：收集细胞上清，用1×PBS清洗两次，0.25%流式胰酶（不含EDTA）消化细胞，轻轻吹打，收集细胞，500×g常温离心5-10min；

   ②悬浮细胞：轻柔吹打，收集细胞，500×g常温离心5-10min；

（2）用1×PBS（4℃预冷）清洗两次，500×g，离心5-10min收集细胞；

（3）用1×Binding Buffer（ddH2O稀释）重悬细胞，调整细胞密度为3-5×105个/ml；

（4）转移300 μL上述细胞悬液至流式管；

（5）每管细胞中加入5 μL的Annexin V-FITC混匀后室温避光孵育15min，之后再加入5 μL的PI混匀后，室温避光孵育5min；

（6）最后补加200 μL的1×Binding Buffer，转移至流式管上机检测；

（7）选择荧光通道FITC和PE通道，检测细胞量在所圈定的细胞群一般收集1×104个细胞。

3.3带GFP荧光细胞凋亡实验步骤（Annexin V-APC/7-AAD）

3.3.1仪器参数调节

（1）收集1×106-3×106个细胞，用预冷PBS清洗两次，500×g，离心5-10min收集细胞；

（2）加入500ul Apoptosis Positive Control Solution重悬，置冰上孵育30min；

（3）用预冷PBS洗涤，500×g，离心5-10min收集细胞；

（4）加入预冷1×Binding Buffer重悬，并加入数量相同且未经处理的活细胞与之混合。加入预冷1×Binding Buffer补充至1.5ml，等分为三管，其中一管为空白对照组，两管为单染管；

（5）流式上机，用单染管调节荧光通道的补偿。

3．3.2样本检测

（1）按照实验方案诱导凋亡；

（2）收集细胞：①贴壁细胞：收集细胞上清，用1×PBS清洗两次，0.25%流式胰酶（不含EDTA）消化细胞，轻轻吹打，收集细胞，500×g常温离心5-10min；

   ②悬浮细胞：轻柔吹打，收集细胞，500×g常温离心5-10min。

（3）用1×PBS（4℃预冷）清洗两次，500×g，离心5-10min收集细胞；

（4）用1×Binding Buffer（ddH2O稀释）重悬细胞，调整细胞密度为1×106-1×107个/ml；

（5）转移100 μL上述细胞悬液至流式管，约1×105-1×106个/管；

（6）每管细胞中加入5 μL的Annexin V-APC和10ul7-ADD，轻柔涡旋混匀后室温避光孵育15min；

（7）最后补加300 μL的1×Binding Buffer，转移至流式管上机检测；

（8）选择荧光通道APC和PerCP通道，检测细胞量在所圈定的细胞群一般收集1×104个细胞。

4、注意事项

1）每管细胞量一般是1×105个；

2）凋亡实验必须收集含有凋亡细胞的细胞上清，不可弃用；

3）细胞消化和清洗过程中动作轻柔，减少细胞碎片；

4） 贴壁细胞消化，用不含EDTA胰酶消化，以免EDTA与Ca2+鳌合，影响    Annexin V结合；

5）需要有两个单染样本，用于调节通道的荧光补偿；

6）实验过程中，工作液及荧光染料需置于冰上。但是染色需在室温进行；

7）加完染料处理后必须在1h内进行流式上机检测；

8）流式图举例

细胞周期检测操作流程

1、实验原理：

由于细胞周期各时相的DNA含量不同，因此，可通过特异性与DNA结合染料来检测细胞内的DNA含量来测定细胞周期。流式中常用碘化丙啶(Propidium，简称PI)与DNA结合，其荧光强度与DNA含量成正比。因此，通过流式细胞仪对细胞内DNA含量进行检测，同时获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过特殊软件计算各时相的细胞百分率。

2、实验材料与仪器：

2.1试剂

无水乙醇：上海凌峰化学试剂有限公司；

Cell Cycle Staining Kit：联科生物； 

流式胰酶：Gibco Company。

流式管。

2.2 仪器

流式细胞仪：

3、实验方法：

3.1 实验流程

3.2 实验步骤

细胞处理前需进行同步化处理，一般用无血清培养基培养24h，也可用秋水仙素进行预处理。

（1）收集细胞（细胞量2×105-1×106）

①贴壁细胞：收集细胞上清，用1×PBS清洗两次，0.25%流式胰酶消化细胞，轻轻吹打，收集细胞，500×g常温离心5-10min；

②悬浮细胞：轻柔吹打，收集细胞，500×g常温离心5-10min；

（2）用1×PBS（4℃预冷）清洗两次，500×g，离心5-10min收集细胞；

（3）用250ul的PBS重悬细胞；

（4）将细胞悬液缓慢加入至750μL的-20℃预冷的无水乙醇中，边加边搅拌混匀，-20℃固定过夜后进行检测，如暂不进行后续实验，可在-20℃保存数日；

（5）1000rpm离心10min离心细胞，弃去乙醇，轻弹管壁使沉淀松散，加入2-5mL室温下的PBS放置15min使细胞再次水化，1500rpm离心5min弃上清；

（6）加入1mL的DNA staining solution混匀，室温避光孵育30min；

（7）将细胞悬液转移至流式管中上机检测。

4、注意事项

1）选择P2门里面收集10000个细胞。

2）实验过程中，工作液及荧光染料需置于冰上。但是染色需在室温进行；

3）加完染料处理后必须在1h内进行流式上机检测。

4）流式图举例：下载本文