刘贺红,万金泉,马邕文,王艳 (华南理工大学环境科学与工程学院,广东广州510006)
摘要 [目的]研究利用DNS 比色法测试污泥中淀粉酶活性,以解决测试条件差异大和测试结果可比性低等问题。[方法]以水解酸化反
应器中的污泥为原料,研究工作波长、显色及培养时间、培养pH 值、灭菌时长等因素对测试结果产生的影响。[结果]结果表明,最大吸收波长处的背景干扰大且测试不稳定,工作波长应在背景干扰相对较小的长波方向选择。该研究的最适工作波长为510nm;显色的适宜时间为8m in ;在培养阶段添加的缓冲溶液pH 值与原污泥pH 值不一致,会造成实际酶活力的放大或缩小;灭菌时间过短则灭菌不完全,会造成测试结果偏低,该研究确定的灭菌时间为10m in ;同时确定了最适的培养反应时间为90m in 。[结论]为DNS 2淀粉酶测定方法的完善提供依据。关键词 生物膜;淀粉酶;DNS 中图分类号 O652.7 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)33-14369-03Study on Determination of Amylase A ctivity in A ctivated Sludge w ith DN S Spectrophotom etry LIU H e 2hong et al (C ollege of Environm ental S cience and Engineering ,S outh China University of T echn ology ,G uangzh ou ,G uangd ong 510006)
Abstract [Objective]T he research aim ed to study the m easurem ent of am ylase activity in activated sludge w ith DNS spectroph otom etry ,and s olve the large difference of test conditions and the low com parability of test results.[Result ]Using the activated sludge of the hydro 2acidification reactor as the ex 2perim ental m aterial ,effects of the w ork wavelength ,pH value ,disin fection and incubation tim e ,the tim e of color reaction were investigated.[Result ]T he re 2sults sh owed that the abs orbency of the reducing product sh ould be m easured at 510nm to abate the disturbance of DNS.T he b oiling tim e for color reaction sh ould be ab out 10m in and the pH value of the bu ffer sh ould be the sam e as the sam ple to av oid m agnifying or lowering am ylase activity.T he disin fection tim e sh ould be at least 10m in.Otherw ise ,the result of the m easurem ent sh ould be lower because of the survival of bacteria.T he best incubation tim e was ab out 90m in.[C onclusion]T he study provided the basis for im proving the determ ination m eth od of am ylase activity based on DNS spectroph otom etry.K ey w ords Bio 2films ;Am ylase ;DNS
作者简介 刘贺红(1983-),女,河南驻马店人,硕士研究生,研究方
向:水污染控制。
收稿日期 2008209222
淀粉酶能催化水解淀粉分子内部的糖苷键生成易于微生物吸收利用的小分子物质,是污水处理系统中重要的胞外酶之一[1]。国内外学者在对淀粉酶进行研究时采用了不同的测试方法[2-4],其中利用3,52二硝基水杨酸(DNS )比色法测定还原糖含量来反映污泥中淀粉酶活力是目前较常采用的方法。该方法测试所用试剂易得,溶液有效期长,且测试精确度高,结果比较可靠。但相关文献在工作波长、培养pH 值、培养时间和显色时间等测试条件上差异较大[5-9],这些差异会直接影响同种测试方法所得酶活力之间的可比性。为此,笔者以水解酸化反应器中污泥产生的淀粉酶为研究对象,采用甲苯灭菌的样品前处理方式[10-11],通过对酶活力测定过程中的工作波长、显色及培养时间、培养时pH 值的控制、灭菌时长等诸多因素对测试结果的影响进行研究,旨在为DNS 2淀粉酶测定方法的完善提供依据。
1 材料与方法1.1 材料
1.1.1 仪器。UV2000紫外可见分光光度仪;SH A 2C 恒温振
荡器;800B 离心机。
1.1.2 试剂。0.5%DNS 试剂:准确称取DNS
2.5g 溶于50ml 2m ol/L 的NaOH 中,在加入75.2g 酒石酸钾钠和100ml 蒸馏
水,微热溶解后定容至500ml ,保存于棕色瓶中。缓冲溶液:柠檬酸2柠檬酸钠缓冲液,T ris 2盐酸缓冲液。葡萄糖标准液:分析纯葡萄糖在80℃下烘干至恒重,精确称取0.2000g ,少量水溶解后定容至200ml ,用时再稀释成所需浓度。
1.2 方法
1.2.1 工作波长对淀粉酶活力测试结果的影响。分别取0.5、1.0mg/ml 葡萄糖1.5ml 于试管中,各加入2ml DNS 试
剂,置于沸水浴中,显色后迅速冲冷,稀释至20ml ,在420～
560nm 波长范围内测定DNS 与葡萄糖反应后的橘红色还原
产物的吸光度。
1.2.2 显色反应时间对淀粉酶活力测试结果的影响。取0.5、1.0、1.5mg/ml 葡萄糖1.5ml 于试管中,各加入2ml DNS
试剂,置于沸水浴中2、4、6、8、10、12、14、16、18min 显色,冷却稀释后测定DNS 与葡萄糖反应后的橘红色还原产物在不同显色时间下的吸光度。
1.2.3 缓冲溶液pH 值对淀粉酶活力测试结果的影响。测
试酶活性时通常添加缓冲溶液来保持培养过程中pH 值环境的稳定。该试验取2种不同污泥样品,分别在原pH 值、pH 值7.1、8.4条件下培养,测定淀粉酶水解产物与DNS 显色后的吸光度。
1.2.4 灭菌时间对淀粉酶活力测试结果的影响。取2.0ml
样品,加入0.4ml 甲苯,分别灭菌0、5、10、15、20、25、30min ,添加基质培养后,测定淀粉酶水解产物与DNS 显色后的吸光度。
1.2.5 培养时间对淀粉酶活力测试结果的影响。设置样品
培养时间为10、30、60、90、120、150、180min ,测定样品中淀粉酶水解产物与DNS 显色后的吸光度。
1.2.6 比色法适合测试的还原产物浓度范围的确定。取不
同浓度的葡萄糖标准液1.5ml 与2ml DNS 试剂,沸水浴显色
8min ,迅速冲冷,定容至20ml ,在510nm 波长下测吸光度A 。1.2.7 样品测定方法。取一定量的污泥,加玻璃珠振荡将
污泥打碎,补加适量蒸馏水,用玻璃棒搅匀制成悬液备用。取生物膜制备液2ml ,甲苯灭菌后加缓冲溶液及1.5%淀粉液各2ml ,在(37±1)℃条件下培养一定时间,然后3000
r/min 离心5min ,取上清液与DNS 在沸水浴(常压下)中显色
后进行比色,将每小时每克污泥(干重)水解淀粉产生的1mg 葡萄糖量定义为1个酶活力单位。
2 结果与分析
2.1 工作波长对淀粉酶活力测试结果的影响 从图1可以
安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.Sci.2008,36(33):14369-14371 责任编辑 姜丽 责任校对 傅真治
看出,葡萄糖与DNS 显色后的还原产物在485nm 处具有最大吸收,而DNS 试剂在450～500nm 波长范围内具有明显的背景吸收,且其吸光度变化幅度大,呈明显的下降趋势,这使得测试数据不稳定,造成较大误差。因此,为降低DNS 的干扰,工作波长最好在DNS 吸收及变化幅度均较小的510～560
nm 波长范围内选择。考虑到检测灵敏度的要求,该试验选
择510nm 处作为比色波长,虽然待测物质在该波长下的吸光度有所降低,
但干扰相对较小。
图1 工作波长对淀粉酶活力测试的影响
Fig.1 E ffects o f w orking w avelength on the test o f amylase activity
2.2 显色反应时间对淀粉酶活力测试结果的影响 根据还
原产物吸光度随显色反应时间的变化关系可以看出,8min 之前,显色吸光度增幅较大,若选此段时间为显色时间,则很小的时间差异就会引起较大测量误差;8min 以后,吸光度增幅缓慢,且还原产物已便于检出,继续增加显色时间已没有太大意义(图2)。所以,确定显色时间为8min
。
图2 显色时间对淀粉酶活力测试结果的影响
Fig.2
E ffects o f colour reaction time on the test resu lts o f amylase
activity
2.3 缓冲溶液pH 值对淀粉酶活力测试结果的影响 试验
结果显示,1号泥样在原pH 值条件下测得的酶活力低于在
pH 值7.1、8.4情况下测得的酶活力,而2号泥样在原pH 值
条件下测得的酶活力要高于改变pH 值后的酶活力。这是因为pH 值能通过改变酶的活性基团或结构来影响酶活性,当测试时所控制的pH 值环境与原污泥的pH 值不同时,酶的状态(活性基团或结构)随之发生了改变,使得测试所得酶活力与该酶在水处理系统中的实际酶活力不同,表现为实际酶活力被放大或缩小。所以,在对水处理系统中的淀粉酶进行测试时,培养阶段添加缓冲溶液的pH 值应与原污泥pH 值一致,才能反映出其在处理废水时的实际酶活力大小。
2.4 灭菌时间对淀粉酶活力测试结果的影响 试验结果表
明,灭菌前10min ,淀粉酶活性变化很大,10min 后,淀粉酶活性变化幅度较小,并呈缓慢下降趋势。这是由于刚加入甲苯时灭菌尚不完全,残余的活菌体将淀粉酶水解淀粉的产物吸收利用,从而造成测试结果偏低。随着灭菌时间的延长,菌体逐渐完全死亡后,不再有胞外酶产生,同时,原来存在的胞外淀粉酶慢慢失活,测试吸光度逐渐缓慢降低(图3)。因此,灭菌时间不能过短,试验选择10min 作为最佳灭菌时间,此
时微生物基本完全死亡,活菌体干扰最小。
图3 灭菌时间对淀粉酶活性测试结果的影响
Fig.3 E ffect o f sterilization time on the test resu lts o f amylase activ 2
ity
2.5 培养时间对淀粉酶活力测试结果的影响 测定酶活性
时,须确定一个适当的培养时间,若培养时间太长,则会由于所生成产物发生变化、酶本身的变性及基质浓度的改变等原因,对测试结果产生不利影响;若时间太短,则基质降解很少,不能产生足够量的待测产物,影响检测。从图4可以看出,90min 为最佳培养时间,此时的显色强度已便于检出,
而且此后的吸光度变化已不大,延长培养时间已没太大意义。
图4 培养时间对淀粉酶活性测试结果的影响
Fig.4 E ffects o f cu lture time on the test resu
lts o f amylase activity
图5 葡萄糖含量与吸光度的关系
Fig.5 R elationship betw een glucose content and absorbency
07341 安徽农业科学 2008年
淀粉酶活力=V×C×稀释倍数/(1.5×泥样体积×
M LVSS)
式中,V为显色反应时所取稀释液体积(ml);C为标准曲线所对应的显色葡萄糖浓度(mg/ml);1.5为培养时间(h)。
3 结论与讨论
该方法具有试剂消耗少、操作简单方便等优点。试验结果显示最佳灭菌时间为10min,灭菌时间过短会造成测试结果偏低;培养阶段添加缓冲溶液的pH值应与原污泥一致,才能反映出其在处理废水时的实际酶活力大小;同时,试验确定最适培养时间为90min;产物与DNS沸水浴中显色8min 后在510nm波长下测试吸光度,数据稳定,干扰小;在测试过程中,要控制葡萄糖浓度在0.4～1.6mg/ml。
参考文献
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127.
(上接第14368页)
表1 加样回收率试验结果(n=3)
T ab le1 The resu lts o f the recovery test w ith added samp les(n=3)
编号N o.
标准硫酸软骨素量∥g/L
S tandard ch ondroitin sulfate am ount
总硫酸软骨素量∥g/L
T otal ch ondroitin sulfate am ount
回收率∥%
Recovery
总回收率∥%
T otal recovery
相对标准偏差∥%
Relative standard deviation
100.2250 ---20.20000.4252 100.10
30.20000.422798.87
40.20000.423199.0799.480.73 50.10000.3255100.53
60.10000.323798.72
70.10000.324699.60
2.5 样品测定 将测定吸光度值代入回归方程,按照标准
曲线法计算样品含量,结果见表2。
表2 硫酸软骨素样品测定结果(n=5)
T ab le2 The determination resu lts o f chondroitin su lfate samp les(n=5)
批号
Batch number 质量分数∥%
M ass fraction
RSD∥%
0808192.510.72 0808293.0.92 0808391.980.90 0808492.150.87 0808593.170.753 小结
试验建立的咔唑分光光度法测定猪硫酸软骨素含量的方法,操作简单,重现性和准确度较好,为提高生产企业产品的含量和纯度提供了方法依据。
参考文献
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17341
36卷33期 刘贺红等 DNS比色法测定污泥中淀粉酶活性的研究下载本文
