酸水解DNS比色法

1、方法原理

还原糖是指含有自由醛或酮基的糖类。单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，利用各种糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来。对非还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解城还原性单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（常以葡萄糖含量计）。

还原糖在碱性条件下加热可被氧化成糖酸及其他产物，而氧化剂3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅成正比关系，利用分光光度计在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子的水，所以在计算多糖含量时应乘以系数0.9。

2、仪器：

制浆机

紫外-可见分光光度计

电子天平

电热恒温水浴锅

3、试剂：

0.1mg/ml葡萄糖标准液：准确称取0.1g在105℃下烘干至恒重的分析纯葡萄糖，加少量水溶解后于1000ml容量瓶中定容，放在冰箱中备用。

DNS显色剂：将6.3g  3,5-二硝基水杨酸和262ml  2mol/L  NaOH溶液，加到500ml含有酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶苯酚和5g亚硫酸钠搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。

碘-碘化钾试剂：称取8g碘和10g碘化钾，溶于100ml蒸馏水中。

酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250ml 70%乙醇中。

6mol/L盐酸

6mol/L氢氧化钠

4、样品制备

(1)称取马铃薯鲜样100g去皮切碎放入制浆机，加水40ml打碎制浆后转移至磨口玻璃瓶中待用；

(2)还原糖提取：从磨口瓶中称取2.0g样品浆液于 100ml三角瓶中，加入50ml蒸馏水搅匀，在50℃恒温水浴中保温20min使还原糖浸出；离心后将上清液转移至100ml容量瓶中，用20ml蒸馏水清洗残渣，再次离心后将上清液同样转入容量瓶中，用蒸馏水定容，即为还原糖待测液。

(3)总糖提取：从磨口瓶中称取2.0g样品放于100ml三角瓶中，加入10ml6mol/L的HCl和15ml蒸馏水，沸水浴加热30min。使用碘-碘化钾溶液检验水解是否完全，水解完全不显示蓝色。冷却后加一滴酚酞试剂，用6mol/L的NaOH溶液中和至微红。过滤样液，用少量蒸馏水冲洗三角瓶和滤纸，滤液和冲洗液收集到100ml容量瓶中，用蒸馏水定容；再从定容后的容量瓶中精确量取10ml于另一100ml容量瓶中定容，即为总糖待测液。

5、DNS比色测定

葡萄糖标准曲线制作

(1)取制备好的葡萄糖标准液按下表添加至25ml容量瓶中：

(3)以葡萄糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标做出标准曲线，计算回归方程。

样品测定

(1)吸取待测液2ml于25ml容量瓶中，加入1.5ml DNS显色剂，定容至25ml，将试样在分光光度计540nm处测定吸光度；

(2)算出的吸光度在回归方程中查出对应的还原糖含量。

6、计算

还原糖含量

式中：

M1：还原糖含量（mg）；

C ：查得的吸光值对应葡萄糖含量（mg）；

Ts1：还原糖分取倍数Ts1=70。

总糖含量

式中：

M2：还原糖含量（mg）；

C ：查得的吸光值对应葡萄糖含量（mg）；

Ts2：还原糖分取倍数Ts2=175。

淀粉含量

式中：

M3：淀粉含量（mg）；

0.9：还原糖含量换算淀粉含量系数。下载本文