摘要

    本次实验以果蝇三龄幼虫唾腺为实验材料，为掌握果蝇三龄幼虫唾腺的剖离技术、掌握唾腺染色体标本的制备方法，并且为对唾腺染色体的形态结构特征进行了观察研究。实验过程中取果蝇三龄幼虫唾腺进行装片制作，并且于显微镜下观察。由于在幼虫消化道或消化腺中存在大体积的多线染色体，并且腺体易剥离，故为实验材料。理想状况下应为唾腺染色体从染色体中心向四周放射状地伸出5长1短的6条臂，但是在实际操作中很难实现分散均匀。所以实验最终得到的染色体多为臂与臂相互纠缠重叠或未伸展完全，除染色中心，可较容易观察到横纹结构。

1.引言

染色体（Chromosome）由脱氧核糖核酸、蛋白质和少量核糖核酸组成的线状或棒状物，是生物主要遗传物质的载体。因是细胞中可被碱性染料着色的物质，故名。其形态和数目具有种系的特性，在细胞间期核中，以染色质丝形式存在，在细胞时，染色质丝经过螺旋化、折叠、包装成为染色体，为显微镜下可见的具有不同形状的小体。

染色体的发现历程：早在1883年，鲁克斯（W·Roux）就观察到细胞核内能被染色的丝状体。1888年，德国人沃尔德耶（W·Waldeyer）称这种丝状体为“染色体”（英语：chromosome；希腊语：chroma=颜色，soma=体），意即可染色的小体，并猜测染色体与遗传有关。1902年，博韦里（T·Boveri）和萨顿（W·S·Sutton）指出，染色体在细胞中的行为与孟德尔的遗传因子平行：两者在体细胞中都成对存在，而在生殖细胞中则是成单的；成对的染色体或遗传因子在细胞减数时彼此分离，进入不同的子细胞中，不同对的染色体或遗传因子可以自由组合。因而，博韦里和萨顿认为，染色体很可能是遗传因子的载体。

染色体研究通常面临两个困难：一是染色体很小，二是除极少数动植物，如玉米粗线期的染色体上具有染色粒这样的结构可以作为识别或定位的标志外，大多数生物的染色体都没有标志，由此提出了多线染色体的概念。多线染色体最早是1881年Balbiani在摇蚊幼虫的唾腺中发现的。1930年，Kostoff提出遗传物质可能位于sprireme横纹上的假设。1932年Emil Heitz与Hans Bauer的实验证实了它的本质是染色体。

研究表明：多线染色体广泛存在于双翅目（Dipetra）、弹尾目（Collembola）昆虫的消化道及消化腺（如肠道、马氏管、唾腺、脂肪体等）细胞中。在本实验中，以D.melanogaster的唾腺为材料，制备、观察这一巨大染色体，了解其唾腺染色体臂的具体形态。

双翅目的昆虫在幼虫期都具有巨大的唾腺染色体，其整个消化管细胞发育到一定程度后就不再进行有丝，而停止在间期，但随着幼虫整体器官和这些细胞本身体积的增大、细胞核中的染色体，尤其是唾液腺染色体仍不断地进行自我复制而不分开，经过许多次的复制形成1000-4000拷贝的染色体，合起来宽达5μm，长达400μm，是普通中期染色体的100-150倍，形成染色体“纽”，又称为多线染色体或巨大染色体。唾腺染色体经过染色后，呈现深浅不同，疏密各异的横纹，这些横纹的数目、位置、宽窄及排列顺序是恒定的，有种的特异性，与基因有对应关系，根据染色体各臂末端的特征，能够判断各臂的归属。组织化学的特异性染色法可对多线染色体中的DNA和RNA进行选择性染色，根据不同的染色方法可以准确观察到DNA 和RNA在染色体上的变化情况。结合不同发育阶段的细胞中染色体的结构的变化以及功能上的变化，可以将其组合成一个动态的胚胎发育过程。构建不同基因活动与细胞分化之间的发育谱。果蝇唾腺染色体与果蝇连锁群间也存在一定的对应关系，果蝇唾腺染色体在细胞遗传学、发生遗传学、进化遗传学、分子遗传学中均有重要应用。

现今关于染色体的研究，最重要的莫过于人类染色体了，即人类基因组计划（HGP;Human Genome Project）：于20世纪80年代提出的，由国际合作组织包括有美、英、日、中、德、法等国参加进行了人体基因作图，测定人体23对染色体由3×109核苷酸组成的全部DNA序列，于2000年完成了人类基因组“工作框架图”。2001年公布了人类基因组图谱及初步分析结果。其研究内容还包括创建计算机分析管理系统，检验相关的伦理、法律及社会问题，进而通过转录物组学和蛋白质组学等相关技术对基因表达谱、基因突变进行分析，可获得与疾病相关基因的信息。人类基因组计划与曼哈顿原子弹计划和阿波罗计划并称为三大科学计划。人类基因组研究的目的不只是为了读出全部的DNA序列，更重要的是读懂每个基因的功能，每个基因与某种疾病的种种关系，真正对生命进行系统地科学解码，从此达到从根本上了解认识生命的起源、种间、个体间的差异的原因，疾病产生的得机制以及长寿、衰老等困扰着人类的最基本的生命现象目的。

而在目前形势下，研究染色体的技术也有了很大的改进。例如原子力显微镜（Atomic force microsopy，AFM）是一种具有超高分辨率的显微成像仪器，可在空气、真空和液体环境下对样本的表面结构进行实时观察。

2.材料和方法

2.1实验材料和仪器：

显微镜、解剖镜、解剖针、镊子、载玻片、盖玻片、吸水纸、滤纸条；改良的苯酚品红染液、1 mol/L的HCl、生理盐水；果蝇的三龄幼虫。

2.2实验步骤和方法：

2.2.1　三龄幼虫的饲养（已做）。

  要制备良好的唾腺染色体，首先需要发育良好的唾腺。要获得发育良好的唾腺需要使用发育良好的肥大的幼虫。这时饲养方法就很讲究。一般遵循以下规则：

  培养基富含营养    按实验一提供给的配方配制培养基。在一龄幼虫出现后，每天在培养基表面薄薄地滴上一层用新鲜的酵母或干酵母配成的2%—4%的水溶液，作为幼虫的补充食物，二、三龄幼虫期则滴加10%左右的酵母菌。培养基的配制方法见实验一。

  虫口密度要小      在一新的培养瓶中接种10对左右亲蝇，24小时后即把它们清除，这样就不会因瓶中虫口密度太大而影响幼虫发育。

  低温培养          在18—20℃的低温下培养。因低温有利于幼虫充分生长发育。但也有人认为低温培养并非必须，25℃培养也同样可行。这两种温度下培养的结果留给同学们自己比较。但有一点要注意：25℃下从接种到出现三龄幼虫的时间大约为5天，而20℃下则为7天左右。为了确保在实验时得到适龄的幼虫，可采取分期接种的方法。

2.2.2  剥取唾液腺。

  在一张载玻片上滴加生理盐水，用毛笔从培养瓶中挑取一只肥大的幼虫，使其没于盐水中。将载玻片置于解剖镜下，取两根解剖针，一根扎于体前1/3处，一根扎于幼虫口器处，并快速一划。

果蝇三龄幼虫唾腺的几个特征：它是上小下大的囊状结构，唾腺旁附着带状的脂肪。解剖镜下（用侧或顶光源照明）可见唾腺是接近透明的结构，而脂肪常呈白色；唾腺上的细胞较大，在解剖镜下依稀可见轮廓，放在显微镜的低倍镜上下调焦可清楚地看到。

  用解剖针去除唾腺以外的组织，再小心剔除唾腺上的脂肪。如果脂肪是紧贴唾腺，无法分离，则选取没有脂肪附着的唾腺部分即可。

2.2.3  解离和染色。

  用小滤纸条吸去生理盐水。在剥净的唾腺上滴一滴1mol/L HCl 解离1-2min，使松软组织利于染色体的分散，解离完毕用滤纸条吸去盐酸。在唾腺上滴加少许蒸馏水，浸泡1-2min后再用滤纸吸去蒸馏水，重复两到三次，以洗净盐酸再用滤纸吸去蒸馏水，滴加改良的苯酚品红染液染色10min。染色时如果染液干了，要及时补充。染色时间不宜过长，否则背景也着色。

2.2.4  制片及观察。

  将载玻片放在平整的台板上，盖上盖玻片。盖前一定要小心地吸去多余的染料（染料太多，则压片时细胞很容易随着染料溢出玻片外，同时亦不便于压片的操作。）。用干净的滤纸条盖住盖玻片的一角，左手压在滤纸条上按住盖玻片，右手持解剖针，用尾部垂直地、螺旋形由中间向四周，轻轻地敲击盖玻片，使细胞分散，染色体平展；最后再用两层滤纸覆盖在盖玻片上，用两个拇指垂直用力按压，按压时不能让盖片滑动。否则会造成染色体的扭曲断裂。然后置于显微镜下观察。

  观察时，先在10*物镜下寻找染色体臂分散良好的整标本，移至视野，换用40*物镜观察染色中心、蓬突、横纹、间纹并根据各条臂末端的特征进行辨认。

3.实验观察

在观察装片的过程中可看到一种结构即染色中心，是唾腺染色体形成时，各条染色体的着丝粒和近着丝粒的异染色质区聚积在一起形成一种结构，此处的染色质连接不紧密，横纹结构也不明显。

当基因活跃转录的时候，多线染色体上的DNA会解开螺旋，在多线染色体上形成球形的突起，称蓬突。蓬突是除了横纹与间纹外多线染色体上另一个重要的特征。

染色质丝上螺旋化程度不同的部分经由多线染色体的“放大”，分别形成染色较深的横纹（band or chromomere）和染色较浅的间纹（interband）。横纹深浅不一，疏密各异，遍布每条多线染色体臂。

D.melanogaster的体细胞染色体数是8，其中第Ⅰ染色体（X染色体）是端着丝粒染色体，在形成唾腺染色体时，着丝粒附着在染色中心，另一端游离，仅形成一条臂。这条臂的末端有一个永久性的蓬突；第Ⅳ染色体臂非常短，附在染色中心边缘。在唾腺染色体中，第Ⅰ与第Ⅳ染色体形成的臂是最容易是别的。比较难识别的是第Ⅱ、第Ⅲ染色体臂。这两条染色体都是中部着丝点染色体，在唾腺染色体中，每条染色体呈“V”形向外伸展出两条臂，形成2L、2R、3L、3R四条臂（L：代表left arm，左臂；R:代表right arm，右臂）。这四条臂的末端形态在不同的制片中会有所变化，需要多次实践，仔细地辨认。

根据染色体臂末端辨别这条臂为X臂

此图片可以清楚地看到染色中心和6条臂，但是第Ⅱ染色体和第Ⅲ染色体的末端确实很难辨认清楚，也只能凭大体形状定义。注：此照片所出装片由张孟然同学制作。

4.结果分析

在制作装片中能清楚地找到染色中心，蓬突，横纹，间纹和X染色体，但是没有十分清楚的完整染色体，尤其是第Ⅱ染色体和第Ⅲ染色体没有清楚地找到，追根究底原因是在制作装片的过程中没有压片均匀，导致染色体臂没有分散开来，以致聚集在一起无法辨析。

    实验过程中需要注意：在分离唾腺时不要将果蝇幼虫的肠道器官扯出，否则不易找到唾腺；在剥除唾腺周围的脂肪组织时由于解剖针体积太大，不易完全剥离使得最后染色时背景出现着色；在实验过程中勿使唾腺干燥；在压片时，应尽量有力均匀，避免压坏盖玻片；用吸水纸吸干液体时应注意不要将唾腺一起吸走，应从液滴边缘逐渐向中间吸；在水洗盐酸时应洗净，都则将无法染色。

5.参考资料及出处

染色体、多线染色体、人类基因组计划  《百度科技名词定义》  全国科学技术名词审定委员会审定公布

染色体病专题网站

《原子力显微镜在染色体研究中的应用》  李琦，郑琪，丁焰，马璐，李立家  西北工业大学生命科学院实验中心；武汉大学生命科学院植物发育生物学教育部重点实验室

http://www.helsinki.fi/~suara/EM/index.html

http://www.hawaii.edu/bio/Chromosomes/poly/poly.html下载本文