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来源：http://www.zhibao17.com/ 更新时间：2013-03-08 阅览1754次

　　植物病害生防细菌的筛选策略综述随着农业种植结构的调整，瓜类和蔬菜保护地的重茬种植现象十分普遍，导致多种病害加剧发生，植物病害检测仪进行病害检测统计，发现以瓜类枯萎病、辣椒疫病等土传病害尤为严重。由于此类病原菌存活于土壤之中，一般化学农药难以奏效，生产中频繁使用高毒农药防治，从而加重了土壤农药的残留。另外，由于长期的化学防治，目前病原菌对现有杀菌剂的抗药性问题十分严重，对当前农业的发展构成了严重的威胁。因此，出于环境保护和食品安全的需求，亟待开发新的、环境友好的高效微生物农药。

　　生物农药源于自然，环境相容性好，且具防效高、作用谱广、对人畜低毒等特点，在病虫害综合治理中，是一类理想的可替代或部分替代化学农药的植保产品。大力发展生物农药及其相关产业符合当前我国农业和环境可持续发展的要求，有利于促进我国农业科技改革和农业产业结构的转型，从发展方向上属于国家优先支持和鼓励发展的领域。而微生物农药因其资源丰富、可再生性强，易于规模化工业生产，在生物农药中占有重要地位，代表着植物保护的方向，未来有望得到迅速发展，在环境保护和农业的可持续发展中发挥重要作用。生防微生物是微生物农药生产的源头，一方面既可利用其活体直接用作农药，又可分离提取其活性代谢产物加工成一定的农药剂型；另一方面，农药的合成经过几十年的结构筛选已几乎遍及可想象的化学类型，化学农药的开发难度越来越大，成本越来越高，而微生物在进化过程中经受环境压力的多样性和复杂性导致了其代谢产物的多样性，为新颖独特的化学结构的发现和新农药的创制提供了更多的机率，因而生防微生物资源的发掘利用也是开发创制新农药的重要途径。

　　1生防菌的主要类群：植物病害生防微生物的主要类群包括真菌、细菌和放线菌。生防真菌研究较多的有木霉、粘帚霉、拟青霉等。已知的木霉9个主要种中有5个种具有生防潜力，至少对18个属29种植物病原真菌有拮抗作用，当前生产上利用最多的是哈茨木霉，国外已有商品化的制剂问世，如美国的哈茨木霉T22和以色列的哈茨木霉。粘帚霉是习居于土壤的重寄生菌，对核盘菌、立枯丝核菌等植物土传病原真菌及线虫有很强的重寄生作用，且能产生次级代谢产物，从粘帚霉中分离获得的抗菌物质已达50多个；近年来对其分离、鉴定、生物学特性、生防作用及其抗病机制的研究均有报道。拟青霉中最着名的是淡紫拟青霉，为植物寄生线虫的重要天敌，能够有效防治根结线虫和胞囊线虫。生防细菌以繁殖速度快、易培养和在植株体内定殖转移等特点成为重要的生防资源。已有研究表明，至少有13个属的细菌具有生防潜力，其中芽孢杆菌属、假单胞菌属和土壤杆菌属是目前研究的热点。芽孢杆菌为土壤和植物微生态优势种群，抗逆性极强，是一类理想的生防菌，应用较多的是枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等，国外已有商品化产品GB03、MBI600、QST713和FZB24等，可防治镰刀菌等引起的根部病害；国内已商品化的制剂有麦丰宁、亚宝、百抗、纹曲宁等，中国农大开发的“增产菌”已在水稻、小麦等50多种植物上应用。假单胞菌是典型的根际细菌，其生防机制主要为营养和病菌侵染位点的竞争，兼有拮抗作用，其中荧光假单胞菌、洋葱假单胞菌、恶臭假单胞菌中的菌系用于马铃薯、胡萝卜和小麦，增产效果分别达5%~33%，6%~14.4%和16.5%~28.1%；着名的植物根际促生细菌(PGPR)亦主要为荧光假单胞菌。放射土壤杆菌主要用于防治根癌病，澳大利亚分离的菌株可完全控制核果类果树和玫瑰根癌病的发生，已在澳大利亚商品化；A.tumefaciens和A.vitis的无致病性菌株D286、HLB-2和F2/5、E26对不同的根癌病也有很好的抑制作用；中国农大开发的放射土壤杆菌可湿性粉剂对核果类果树根癌病防效达100%，已于2000年获得注册登记。放线菌是最早发现的具有生防效果的微生物，其生防作用主要靠产生生物活性物质，在已发现的微生物活性产物中，约有2/3由放线菌产生，而链霉菌是最重要的抗生素产生菌，生产上应用的农用抗生素约80%的活性成分均源于链霉菌，目前国内对生防放线菌的利用也主要集中于抗生素，如井冈霉素全国推广面积年约达870万hm2，其它如农抗120、多抗霉素、武夷菌素、中生菌素、宁南霉素等也已正式登记或临时登记；放线菌的活剂已广泛应用的是Mycostop，主要用于防治腐霉菌、镰刀菌、疫霉菌和丝核菌等引起的土传病害；我国分离获得的细黄链霉菌制成的“5406”抗生菌也有一定的推广面积。

　　2生防菌的筛选策略：长期以来，微生物资源的开发利用以医药开发为主导，特别是对放线菌类所产生的医用抗生素的研究较多。在分离和筛选方法上，20世纪60年代中期以前，由于有丰富的微生物资源可供研究，不需复杂的方法便能随机筛选到目的菌株。随着科学技术的不断进步，开发新药物的难度也大大增加，因此，许多新筛选方法应运而生。报道较多的新药筛选方法有靶标定向筛选和高通量筛选，前者是将某种药物或其特异基团作为靶标进行定向检测而建立各种不同的筛选程序，大大提高了新药筛选效率；后者则由化合物库、靶体选择、靶体和化合物反应的测试方法、靶体作用物的高通量筛选和数据的信息处理系统组成筛选平台，针对各种药物靶体从种类繁多的化合物中筛选最佳的先导化合物，进而开发新药物。此外，快速分子筛选方法也已得到应用，美国Cyanamid公司运用独特的分子筛选技术从世界各地采集的海洋微生物中寻找具有抗菌、抗病毒、抗癌等苗头的药物；我国徐平等依据放线菌基因组中大环聚酮类化合物生物合成途径所用的I型PKS合成酶基因的存在与否标定可能的大环聚酮类天然产物产生菌，建立了快速、简便、高效的大环聚酮类化合物产生菌基因筛选体系。分子生物学和分子药理学的研究阐明了许多生物大分子如酶、受体和离子通道等与病害之间的关系，这些生物大分子正逐步取代传统的药物筛选方法，发展成为药物初筛的主要靶标。　　在微生物栖息环境的选择上，许多实验室已转向极端环境微生物资源研究，包括嗜碱、嗜盐、嗜酸、极端高低温、高压、辐射等特殊环境微生物以及植物内生菌，近年海洋微生物资源也成了新的研究热点。在药源微生物的类群上，特别是在放线菌中，链霉菌以外的稀有放线菌被认为是新药的重要来源。

　　据估计，每克土壤中微生物数量高达4000种，而采用现有技术能够培养的仅为微生物总数的1%~10%，多达90%~99%的不可培养微生物正在成为开拓新资源的目标；基于此，Handesman等提出了一个全新的理念———“宏基因组克隆”，直接提取环境中所有微生物的基因组DNA，克隆到合适的载体，构建宏基因组文库，再运用序列筛选或功能筛选方式从文库中获得酶、抗生素等生物活性物质及相关基因。该研究策略克服了多数土壤微生物无法分离培养的难题，增加了获得新生物活性物质的机会，已得到成功的应用。迄今人类所认知的真菌约7万多种，细菌5000多种，放线菌3000多种，而实际利用的可能还不到0.1%，再加上90%~99%未知的种类，可见对自然界微生物资源的研究和开发仍有十分广阔的空间。

　　3目前研究中存在的问题与对策：植物病害生防微生物菌种的评价和筛选传统上注重其生物活性的考察，一般以作物病害没有发生、病害减少或不能发展的土壤为主要来源，经室内离体生测、温室植株接种和田间防效实验，最终筛选出可在生产上应用的生防菌。

　　此过程历时长，工作量大，且室内筛选和田间应用的效果往往不一致，造成菌株的漏选。更重要的是，如上所述，经过多年的活性筛选，传统的方法在常规的生态环境中已很难获得具有新活性或产生新物质的菌株，所以往往是已知活性菌株的重复性试验和小范围内的应用，缺少创新性的突破，也就很难形成规模化生产。近年对一些与抗病作用机制有关的基因或酶类等生物大分子的检测技术也逐渐应用到生防菌的筛选和评价研究中，如通过PCR技术检测镰刀霉素合成基因fusA、β-1,3-葡聚糖酶基因、表面活性肽合成基因、几丁质酶基因，通过生化的方法检测木霉生防菌株中几丁质酶的活力等。但总的看，生防微生物资源的研究较医药微生物资源相对落后，因此，借鉴医药源微生物资源开发的新技术，优选生防微生物发掘的生态环境，扩大筛选范围和信息的获取量，加强生防微生物新颖性的科学评价，在此基础上建立新的高效菌株筛选体系，以增加新菌株发现的机率，是微生物新农药创制中亟待加强的重要基础科学问题。

　　我国微生物资源丰富，发展微生物农药的条件得天独厚。而如何从丰富的微生物资源中分离筛选创新性菌株是成功创制微生物新农药、开发自主知识产权的新产品的先决条件。目前我国生物农药占市场份额仅为1.7%左右，远低于世界平均水平，与发达国家相比尚有较大差距，存在的突出问题主要是：仿制国外产品多，原创性拳头产品少。究其原因，对生防微生物资源的创新性研究不够，虽然筛选获得了许多具有抗病活性的目标生物，但缺乏能够用于生产新农药的高效菌株是关键性瓶颈之一。因此，在未来研究中，研究者需利用现代生物技术与传统的生物学方法有机结合，搭建生防微生物资源创新研究平台，发掘新的生防微生物资源，力争在新的关键生防因子的发现和利用方面有所突破。

菌根真菌和生物有机肥结合对棉花土传黄萎病防控作用及其机制

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【作者】 张国漪； 

【导师】 冉炜； 

【作者基本信息】 南京农业大学， 植物营养， 2012， 博士

【摘要】 棉花土传黄萎病是棉花连作障碍的主要病害之一,是一种典型的土传病害,其病原菌为大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb).传统的化学防控通常会带来环境问题而田间防控措施如轮作和采用抗病品种等也存在许多性因素,生物防控日渐成为克服土传植物病害的重要途径。已有的研究表明菌根真菌或死谷芽孢杆菌菌株(Bacillus vallismortis,HJ-5)单独施用对防控棉花土传黄萎病有效果,但二者共同接种对防控棉花土传黄萎病的防控效果和协同作用机制尚未见报道。本文首先通过盆栽试验筛选了适于双接种试验的菌根菌菌株和菌株HJ-5的菌剂接种量。通过三次的温室盆栽试验研究了结合施用地表球囊霉(Glomus versiforme, Gv)和死谷芽孢杆菌强化的生物有机肥对棉花土传黄萎病的防病效果。采用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)标记技术构建了菌株HJ-5的GFP标记菌株(GHJ-5),研究了菌株GHJ-5在植株根表和根际的定殖行为。在温室条件下利用分根试验研究了菌株HJ-5和Gv单独接种和混合接种对棉花根系分泌物及抑病效果的影响。另外,还通过一系列的实验室和温室试验了研究病原菌和拮抗菌之间的互作关系。主要结果如下。1.筛选菌根菌和菌株HJ-5接种量的试验结果表明,双接种处理的最适菌根菌菌剂为菌株Gv,菌株HJ-5的最适用量为107CFU·g-1.菌株Gv和HJ-5双接种处理的土传黄萎病发病率最低,发病指数下降了26.71%,植株生物量显著增加。2.三次的盆栽试验一致表明,育苗时先接种菌根真菌菌株Gv,移栽时再在连作土壤中施用死谷芽孢杆菌发酵的生物有机肥,防控棉花土传黄萎病的效果最好,发病指数平均降低65%,植株地上部高度,叶面积,地上,下部干重量三次平均分别增加75%,44%,216%,和71%。植株地上部和地下部N和P含量显著增加。对照相比,植株地上部和地下部N含量分别增加83%和65%；地上部和地下部P含量分别增加49%和45%。根际土壤Verticillium dahliae数量显著降低,下降幅度达83%。值得注意的是,菌株Gv在植物根的定殖没有受施用HJ-5生物有机肥的影响。3.实验室分析表明,菌株HJ-5能产生脂肽类物质、吲哚乙酸(IAA)、铁载体、氰化氢(HCN)、氨气,但不产脱氨酶(ACC),不具有解磷能力。GFP标记菌株GHJ-5能够定殖在土传黄萎病病原菌的菌丝上并使其变形和裂解,表明菌株HJ-5为土传黄萎病的拮抗菌。4.双接种菌株Gv和GHJ-5的盆栽试验结果表明,与单接种菌株GHJ-5或Gv相比,棉花植株的生物量、根系密度、植株磷含量、棉花植株根内和根际的菌株GHJ-5的数量都有显著增加,说明菌株Gv与GHJ-5双接种能够促进棉花的生长。5.分根试验表明,双接种菌株Gv和HJ-5处理棉花土传黄萎病发病指数比对照下降了63.3%。棉花根系分泌物中发现4种酚酸,所有酚酸在低浓度时促进大丽轮枝菌的生长和孢子的萌发,浓度升高到一定程度,抑制病原菌孢子的生长。接种菌株Gv和HJ-5显著地减低了根系分泌物中酚酸类物质的浓度。接种V. dahliae、菌株Gv或HJ-5均系统性地改变了根系分泌物的组成。6.对盆栽试验植株样品的分析表明,双接种菌株Gv和HJ-5显著提高了植株防卫酶如内过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、几丁质酶等酶的活性,增加了叶片水杨酸和叶绿素含量、降低了植株茎基部胼胝质含量,减轻棉花土传黄萎病发病症状。综上所述,本文证实了菌株Gv和HJ-5双接种处理具有协同促进植物生长和抑制植物病原菌生长的作用。菌株Gv能够帮助植物吸收土壤中的养分元素,菌株HJ-5具有产生拮抗物质的能力,二者在土壤和植株上的成功定殖是防控棉花土传黄萎病的关键。接种菌株HJ-5和Gv对棉花根系分泌物的改变作用与植物系统抗性有关,这与接种菌株HJ-5和Gv之后植物防御性酶活性等特征的变化是一致的。本文的研究结果有助于研发新型棉花土传黄萎病防控技术。今后应进一步研究生物有机肥中功能菌在修复土壤障碍因子中的分子生物学机制。 更多还原

【关键词】 棉花； 黄萎病； 死谷芽孢杆菌； 地表球囊霉； 根际土壤； 根系分泌物； 

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