熟悉不同临时玻片制作方法；通过观察，认识病原真菌的营养体及其变态，认识真菌的子实体、有性繁殖、无性繁殖产生的各种类型孢子。

二、实验用具

    挑针、刀片、木板、酒精灯、火柴、载玻片、盖玻片、纱布、（棉蓝）乳酚油、二甲苯、显微镜、擦镜纸、吸水纸等。

三、内容与方法

1．临时玻片的制作 

    临时玻片制作方法很多，如涂、撕、粘、挑和切片等，可以根据病原物的类型选择使用。

（1）涂抹法：细菌和酵母菌的培养物常用涂抹法制片。将细菌或酵母菌的悬浮液均匀地涂在洁净的载玻片上，在酒精灯火焰上烘干、固定，再加盖玻片封固。加盖玻片前还可进行染色处理，使菌体或鞭毛着色而易于观察。

（2）撕取法：用小金属镊子仔细撕下病部表皮或表皮毛制成临时玻片。

（3）粘贴法：将塑料胶带纸剪成边长5mm左右的小块（注意胶带上不要印有指印），使胶面朝下贴在病部，轻按一下后揭下制成玻片。

（4）挑取法：用挑针从病组织或基物（如培养基）上挑取表面的霉状物、粉状物或孢子团制成玻片。

（5）组织透明法：将少量病组织材料切成细丝后放在载玻片上，滴加乳酚油后在酒精灯上徐徐加热至蒸气出现。如此处理数次使组织透明，冷却后加盖玻片进行镜检。此法可以观察到病原物在寄主内的原有状态。

（6）徒手切片：徒手切片时选取病状典型、病征明显的病组织材料，先在病征明显处切取病组织小块（边长5－8mm），放在小木块上，用食指轻轻压住，随着手指慢慢地后退，用刀片的刀尖将压住的病组织小块切成很薄的丝或片，用沾有浮载剂的挑针或接种针挑取薄而合适的材料放在一干净载玻片上的浮载剂液滴，盖上盖玻片，仔细擦去多余的浮载剂（注意浮载剂过多会使观察物出现晃动不稳定现象），即制成一张临时玻片。

浮载剂：

水：溢菌、线虫活动、真菌孢子萌发、大小测量

–        优点：方便

–        缺点：产生气泡；易干燥

乳酚油：除上述外均可用。

–        优点：杀菌固定、孢子膨胀复原、组织透明

–        缺点：不易封固、有毒

    取小麦白粉病叶片，分别用上述6种方法制片，观察白粉病菌的分生孢子梗、分生孢子、菌丝和吸器。并比较每种方法分别适于观察白粉菌的什么形态特征。

2． 病原真菌的营养体

    用挑针挑取平板上培养好的瓜果腐霉病菌（Pythium aphanidermatum）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）和链格孢菌（Alternaria sp.）的菌丝体，用蒸馏水作浮载剂，制临时玻片镜检，观察菌丝有无隔膜？菌丝体直径变化是否明显？颜色有无差别？

2．1 真菌营养体的变态 

（1）吸器：吸器的形态有圆球状、棒状、裂片状、掌状、根状等。观察用撕取法制片的小麦白粉病菌（Blumeria graminis）吸器形态，注意吸器的形状和在细胞内的位置。为便于清楚观察，也可以用棉蓝乳酚油作为浮载剂。

（2）假根：是由菌丝分化的根状分枝。挑取甘薯软腐病菌（Rhizopus stolonifer）平板培养物制片镜检，观察在孢囊梗基部的假根的形态和颜色。

（3）菌核：是菌丝体的菌丝纠结而成的坚固的颗粒状休眠体。观察油菜菌核病菌（Sclerotium sclerotiorum）的菌核和小麦麦角病菌(Claviceps purpurea)的菌核标本。比较两种菌核的大小、形状和色泽有何不同？

（4）根状菌索：许多菌丝体平行生长并纠结成绳索状，称为根状菌索。在示范镜下观察苹果或甘薯紫纹羽病菌(Helicobasidium purpureum)的根状菌索。       

（5）子座：由菌丝体或由菌丝体和寄主组织共同组成的着生子实体的垫状物。在子座上形成无性或有性孢子。在显微镜下观察麦角病菌（Claviceps purpurea）头状子座的切片，注意其内部结构与菌核有何区别，或镜检大叶黄杨叶斑病菌或紫荆叶斑病菌（Cercospora sp.）的垫状子座。

3． 病原真菌的繁殖体——子实体 

3．1 无性孢子 

（1）游动孢子囊和游动孢子：鞭毛菌亚门真菌的无性繁殖器官是孢子囊。大多数鞭毛菌孢子囊可释放出具鞭毛、在水中能游动的游动孢子，故其孢子囊又称为游动孢子囊。镜检腐霉菌(Pythium sp.)和疫霉菌(Phytophthora sp.)的游动孢子囊形态,注意孢囊梗与菌丝有无区别。

（2）孢子囊和孢囊孢子：接合菌亚门真菌的无性繁殖器官是孢囊孢子。镜检根霉菌（Rhizopus spp.）、毛霉菌（Mucor spp.）、犁头霉菌（Absidia spp.）的孢子囊、孢囊孢子。

（3）分生孢子：半知菌亚门真菌和子囊菌的无性世代繁殖时都可产生分生孢子。分生孢子多着生在分生孢子梗上。分生孢子梗有色或无色、散生或聚生，或着生在分生孢子座、分生孢子盘或分生孢子器内。

采用挑、刮或切片的方法制作临时玻片，观察下列病原菌分生孢子的颜色、分隔；分生孢子梗的形态、颜色，是否分枝及分枝的类型、着生位置等。

玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）

花生黑斑病菌（Cercospora arachidicola）

小麦白粉病菌（无性世代）（Oidium monilioides）

柑桔青霉病菌（Penicillium italicum） 

棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae）

稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）

马铃薯早疫病菌（Alternaria solani）

（4）厚壁孢子：又称厚垣孢子。由菌丝中个别细胞膨大、细胞壁加厚而形成的一种厚壁孢子。对不良环境的抵抗能力较强。

挑取棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）或樟疫霉（Phytophthora cinnarnomi）的培养物制片镜检，观察厚垣孢子的形状、颜色和孢子壁的厚度。

3．2 有性孢子 

（1）卵孢子：是鞭毛菌亚门真菌产生的有性孢子，常由形态、大小不同的雌、雄性器官交配形成。卵孢子通常形成于藏卵器内，每个藏卵器内可包含1至多个卵孢子，其数目因真菌种类不同而异。

挑取疫霉（Phytophthora sp.）的培养物（连同培养基）制片、镜检观察藏卵器的形态、色泽、壁有无饰纹或光滑；雄器形态及其位置；卵孢子形态、每个藏卵器内卵孢子的数目、卵孢子是否充满藏卵器。

（2）接合孢子：是接合菌亚门真菌产生的有性孢子，由两个形状和大小相似的雌、雄配子囊结合而成。

挑取根霉（Rhizopus sp.）、毛霉(Mucor sp．）或犁头霉（Absidia sp.）正、负菌株在PDA培养基上交配7－10天后的培养物制片、镜检，观察接合孢子的形状、表面的饰纹、色泽、配囊柄的形状及有无丝状附属物。

（3）子囊孢子：子囊菌亚门真菌的有性孢子，产生在子囊内。子囊孢子有色或无色、单胞或多胞，具多种形状。

采用挑、刮或切片的方法制作临时玻片或直接观察永久玻片，镜检下列病原物。观察子囊孢子的形态、颜色；子囊的形态；子囊果的类型。

桃缩叶病菌（Taphrina deformans）

小麦白粉病菌（Erysiphe graminis）

桑里白粉病菌（Phyllactinia corylea）

小麦赤霉病菌（Gibberella zeae）

苹果树腐烂病菌（Valsa mali）

麦角病菌（Claviceps purpurea）

（4）担孢子：担子菌亚门真菌产生的有性孢子。担孢子产生在担子上。

观察胶锈菌（Gymnosporangium sp.）冬孢子萌发形成的担子及担孢子的形态。

四、作业与思考题

（1）认识病原真菌菌丝、无性孢子、有性孢子有何意义？

（2）说明针对不同的病征类型在显微镜观察时应采用何种制片方法？

（3）填图，注明图1中各部分的名称。

 图1病原真菌子实体形态图（填注各部分名称）

1.鞭毛菌 2.接合菌 3.子囊菌 4.担子菌

通过对半知菌中各类型代表菌的观察，了解半知菌的分类依据，掌握半知菌主要属的形态特征及其所致主要病害的症状特点，进一步学习和训练徒手切片技能。实验分两次进行。 

二、材料和用具 

显微镜、擦镜纸、装有浮载剂的滴瓶、挑针、刀片、小垫板、载玻片、盖玻片、小纱布。相关病害的标本或病菌的培养物或永久玻片。 

三、内容与方法 

1 丝孢纲（Hyphornycetes） 

（1）梨孢属（Pyricularia）：取稻瘟病（P．oryzae）的发病小枝梗或茎节保湿，挑取病部灰白色霉层制片镜检，观察分生孢子梗和分生孢子的形态。认真观察稻瘟病标本的症状，扼要描述稻瘟病的几种症状特征和类型。 

（2）粉孢属（Oidium）：引起植物白粉病。观察小麦白粉病（Oidium monilioides ）标本的症状。挑取少许粉状物制片镜检观察，注意分生孢子梗和分生孢子的形态及分生孢子的排列方式。 

（3）青霉属（Penicillium）：柑桔青霉菌（P．italicum）是柑桔贮藏和运输期中的重要病原菌。观察由青霉菌引起的柑橘、苹果、梨等果腐症状特点。挑取发生果腐病水果表面白色菌丝附近的青色霉层制片，观察青霉菌分生孢子梗及孢子，注意观察分生孢子梗的分枝和顶端产孢细胞的形态特征。 

（4）尾孢属（Cercospora）：仔细观察由尾孢属真菌引起的花生黑斑病（C. personata）的症状特点。取花生黑斑病叶片做徒手切片，或取花生黑斑病菌永久玻片镜检观察子座、分生孢子梗和分生孢子的形态特征。注意观察分生孢子梗着生的方式及其顶端的形态、分生孢子梗和分生孢子的颜色及分生孢子的形状及分隔情况。 

（5）镰孢属（Fusarium）：观察由棉花枯萎病菌（F．oxysporum f.sp.vasinfectum）、小麦赤霉病菌（F.graminearum）和水稻恶菌病菌（F．moniliforme）引起的植物病害症状特点。观察上述三种病原菌培养物的形态，注意培养物（基）的颜色变化。挑取培养物制片观察大型分生孢子（镰刀形，多细胞，基部有时有一显著的突起，称足胞）和小型分生孢子（单胞，无色，椭圆形），观察有无分生孢子座。有的镰孢菌还产生一种厚壁孢子（厚垣孢子），是病菌在不良条件下形成的休眠孢子，抵抗不良环境的能力强。观察菌丝上或大型分生孢子上有无厚垣孢子。 

（6）轮枝孢属(Verticillium)：大丽轮枝菌（V．dahliae）是引起棉花黄萎病的病原菌。观察人工培养的大丽轮枝菌菌落和微菌核形态特征，用刀片将菌丝块切成一薄片，侧放在载玻片上，置于低倍镜下镜检，调节微调可见到无色分生孢子梗，主轴分成几节，节处有2至多个分枝，每个分枝和主轴的顶端着生有多个分生孢子，形成分生孢子球。分生孢子单细胞，无色，长椭圆形。观察棉花黄萎病标本症状，注意维管束变色，并与棉花枯萎病维管束变色对比观察。 

（7）链格孢属（Alternaria）：茄链格孢（A．solani）引起马铃薯和番茄早疫病，观察早疫病病叶上的褐色同心轮纹病斑，病斑上有黑色霉状物。选择有褐色同心轮纹病斑处，徒手切片制成临时玻片镜检。观察分生孢子梗和分生孢子的形态、颜色。注意分生孢子顶端有喙状细胞。 

（8）离蠕孢属（Bipolaris）：玉蜀黍离蠕孢（B.maydis）引起玉米小斑病。观察玉米小斑病标本的症状。取玉米小斑病叶制成临时玻片，或用玉米小斑病菌的永久玻片镜检。观察：分生孢子梗的着生情况，分生孢子梗的颜色、有无分枝和曲膝状形态;分生孢子的颜色、多胞、纺锤形常向一方弯曲的形态特点;脐点稍微突出，平截状。分生孢子萌发时，两端细胞萌发。此外，稻离蠕孢菌(B.oryzae)引起水稻胡麻斑病，也可作为镜检材料。 

（9）突脐蠕孢属（Exserohium）：大斑病突脐蠕孢（E.turcicum）引起玉米大斑病。观察玉米大斑病标本的症状特点，并在病斑大小和形状上与玉米小斑病进行比较。取玉米大斑病叶制成临时玻片，或用玉米大斑病菌的永久玻片镜检。观察分生孢子梗和分生孢子的颜色、分隔和形态特征。注意分生孢子的脐点明显突出于基细胞外。分生孢子萌发时两端细胞萌发。 

(10)凹脐蠕孢属(德氏霉属Drechslera)：该菌寄主范围窄，侵染禾本科植物和其他植物叶，引起叶斑病。观察小麦叶枯病（D. tritici）标本，注意症状特点；镜检小麦黄斑德氏霉病制备片，观察分生孢子梗单生或簇生，褐色具隔，上部呈曲膝状，孢痕明显，分生孢子圆柱形，两端钝圆，淡褐色，多细胞，脐点腔孔状，凹陷于基细胞内。萌发时每个细胞均可伸出芽管。有性态为核腔菌属（Pyrenophora）。注意其与平脐蠕孢属和突脐蠕孢属的区别.

（11）丝核菌属（Rhizoctonia）：本属真菌不产生任何无性孢子。茄丝核菌（R. solani）侵染多种植物幼苗或幼茎茎基部引起立枯病，侵染水稻、玉米和小麦等引起纹枯病。观察水稻纹枯病标本、棉花立枯病标本症状特点。观察丝核菌人工培养物形态，幼龄菌丝无色，后期呈褐色。挑取培养的水稻纹枯病菌菌丝体，制片观察菌丝的颜色、分枝处的缢缩、分枝附近的隔膜和分枝间形成的角度。注意初生菌丝和次生菌丝分枝间的角度常有不同。 

2 腔孢纲（Coelomycetes）

（1）炭疽菌属（Colletotrichum）：观察棉花炭疽病（C.gossypii）、辣椒炭疽病（C. piperatum）、豆类炭疽病（C.truncatum）的病害标本症状特征。比较症状类型、病斑特点及病征。选取任一炭疽病材料做徒手切片，镜检。注意有无刚毛？刚毛的颜色如何？刚毛有无分隔？如何将刚毛与植物的表皮毛区分开？分生孢子盘的形状、分生孢子梗的形状和分布？分生孢子的颜色和形状？分生孢子有无分隔？ 

（2）拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis）：以大叶黄杨叶斑病或枇杷灰斑病（P.funerea）为材料，选取粗大的小黑点，徒手切片，镜检。观察分生孢子的分隔数、分生孢子各细胞的颜色变化、分生孢子顶端附属丝根数和形状。注意：分生孢子分隔的多少是区分拟盘多毛孢属和盘多毛孢属（Pestalotia）的重要标志，盘多毛孢属分生孢子5个隔膜，6个细胞；拟盘多毛孢属4个隔膜5个细胞。 

（3）茎点霉属（Phoma）：取葡萄黑腐病（Phoma viticola）材料,徒手切片置于显微镜下检查,分生孢子器球状或扁球状，内壁有分生孢子梗。分生孢子单胞，无色。观察葡萄黑腐病和水稻谷枯病症状。 

（4）叶点霉属（Phyllosticta）：该属和茎点霉属在形态上相似，比较难以区分。传统上把寄生植物茎上的，产生分生孢子器，具有小型、无色单细胞分生孢子的真菌鉴定为茎点霉属，把寄生植物叶片的该类真菌鉴定为叶点霉属。取栀子花叶斑病叶片，观察症状特征，并做徒手切片，镜检，观察病菌的分生孢子器、分生孢子的形态特征。 

（4）大茎点菌属（Macrophoma）：观察大叶黄杨病叶材料，作徒手切片,镜检。观察分生孢子器、分生孢子梗和分生孢子的形态特征，并与茎点霉属和叶点霉属相比较，注意比较分生孢子的大小。大茎点菌属分生孢子大小一般超过15mm。 

苹果轮纹病菌（M.kawatsukai）主要为害苹果、梨的枝干及果实，取切片镜检病原菌的分生孢子器、分生孢子梗、分生孢子。观察标本症状。 

（5）拟茎点霉属（Phomopsis）：取茄褐纹拟茎点霉（P.vexans）永久玻片或取茄褐纹病材料徒手切片，镜检观察分生孢子器内产生的两种分生孢子分别是什么形状？注意只有观察到线形分生孢子才能确定为拟茎点霉属。观察茄子褐纹病、芦笋茎枯病症状特点。 

（6）壳针孢属（Septoria）：观察小麦叶枯病菌（S．fritici）永久玻片或取一年蓬叶斑病病叶作材料徒手切片，镜检观察分生孢子器的形状和分生孢子的形状，注意分生孢子有无分隔。 

（7）色二孢属（Diplodia）：取棉花黑果病菌（D．gossypina）的永久玻片镜检，观察分生孢子器和分生孢子的形态。注意分生孢子的颜色和分隔，单胞、无色的为初期未成熟孢子；褐色、双细胞的为成熟孢子。观察棉花黑果病病害症状。 

（8）壳二孢属(Ascochyta)：取蚕豆褐斑病菌（A．fabae）永久玻片镜检，观察分生孢子器和分生孢子的形态；注意分生孢子的颜色和隔膜数。分生孢子初期单胞，后期双胞。观察蚕豆褐斑病的症状特点。 

四、作业与思考题 

（1）绘梨孢属、尾孢属和镰孢属的分生孢子梗和分生孢子形态图。 

（2）绘炭疽菌属和拟盘多毛孢属的分生孢子盘和分生孢子形态图。 

（3）绘拟茎点霉属和壳二孢属分生孢子器和分生孢子形态图。 

（4）在显微镜下你能分辨出分生孢子器和子囊壳吗？如何区别？