(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510443859.4
(22)申请日 2015.07.27
C12N 1/20(2006.01)
(71)申请人厦门市科环海洋生物科技有限公司
地址361000 福建省厦门市同安工业集中区
思明园326号
(72)发明人
蔡荣淮 周勇 戴志清
(54)发明名称
一种高浓度光合细菌的培养基及其培养方法
(57)摘要
本发明公开了一种高浓度光合细菌的培养基
及其培养方法，利用本发明的培养基进行荚膜红
假单胞菌发酵培养，在培养过程中的第36小时和
第60小时，补充荚膜红假单胞菌生长的营养增强
剂浓缩液，延长荚膜红假单胞菌的生长对数期；
在光合细菌四级发酵过程中，每12小时将光照强
度提高10%~20%；采用可见光分光光度计测定10
倍稀释发酵液在600nm 波长下的吸收值，即OD 600nm
值；直至OD 600nm 值不再增加时才终止发酵；发酵液
中的荚膜红假单胞菌浓度可达到20×109个/mL。
本发明可以为大规模生产高浓度的光合细菌起到
重要的指导意义。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书3页 附图1页CN 105087430 A 2015.11.25
C N 105087430
A
醋酸钠5.0 g/L，丙酸钠1.0 g/L, 酵母膏4.0 g/L, 氯化钠2.0 g/L, 磷酸氢二钾0.5 g/L, 磷酸二氢钾 0.5 g/L, 硫酸镁0.5 g/L, 碳酸氢钠2.0 g/L, 硫酸铵 1.0 g/L, 辅助营养液2mL，水998mL，pH 7.0~7.5；其中，辅助营养液为：烟酸胺0.005 g/L，生物素0.001 g/L，泛酸钙0.003 g/L，维生素B1 0.007 g/L，维生素B6 0.007 g/L。
2.一种高浓度光合细菌的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、菌种准备：以荚膜红假单胞菌作为培养菌株；
步骤二、发酵培养基制备：按照如权利要求1所述的组分配制培养基；
步骤三、一级种子培养：将荚膜红假单胞菌单菌落接入灭菌过的30mL试管培养基中，橡胶塞密封；在光照培养箱中恒温培养，温度30~35℃，光照强度3000~5000Lx；培养至深棕红色，菌体浓度在109~1010个/mL，结束培养，制得一级种子液；
步骤四、二级种子培养：以一级种子液作为种子液，按照体积比15%~20%的接种量接入灭菌过的1000mL三角瓶培养液中，橡胶塞密封；在光照强度3000~5000Lx下厌氧培养，每日摇荡3~5次；培养至深棕红色，菌体浓度在109~1010个/mL，制得二级种子液；
步骤五、三级种子培养：以二级种子液作为种子液，按照体积比15~20%的接种量接入灭菌的10L细口广口瓶培养液中，橡胶塞密封；在光照强度3000~5000Lx下厌氧培养，每日上下翻转摇荡3~5次；培养至深棕红色，菌体浓度在109~1010个/mL，结束培养，制得三级种子液；
步骤六、四级发酵培养：以三级种子培养液作为种子液，按照体积比15~20%的接种量接入已经通过1%高锰酸钾溶液消毒处理的耐高压、酸碱PE袋中，装液量为200L，袋口采用消毒的尼龙绳扎紧；在光照强度在2000~4000Lx下，采用上下双层光照培养；每6小时取样分析，通过可见光分光光度计测定10倍稀释发酵液在600nm波长下的吸收值-OD600nm值，直至OD
值不再增加时终止发酵培养。
600nm
3.如权利要求2所述的一种高浓度光合细菌的培养方法，其特征在于：在所述四级发酵培养过程中的第36小时、60小时分别补加20倍浓缩发酵液；每次补加浓缩发酵液后，上下震荡培养袋1分钟，继续厌氧光照培养；在发酵过程中的每隔12小时调整光照强度，使光照强度逐渐增强，增强幅度为每次10%~20%。
一种高浓度光合细菌的培养基及其培养方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种高浓度光合细菌的培养基及其培养方法。
背景技术
[0002] 光合细菌（photosynthetic bacteria ）简称PSB，是一类在厌氧光照条件下进行不产氧光合作用或好氧黑暗条件下利用有机物作为供氢体兼碳源的革兰氏阴性细菌。在分类上属于红螺菌目，包含红螺菌科、红硫菌科、绿硫菌科和绿色丝状菌科等四科类，一共有18个属，约40余种。光合细菌自身营养丰富，细胞干物质中蛋白质含量高达60%，同时还富含有天然抗氧化剂辅酶Q、类胡萝卜素等生理活性物质。光合细菌在自然界碳素、氮素、硫素转化中起到重要作用。
[0003] 国内外相关研究表明，生产光合细菌的主要方式分为动态培养方式和静态培养方式。国外有采用透光的密闭式光生物反应器进行动态连续培养光合细菌，国内多采用玻璃缸或塑料袋进行自然发酵培养。在自然发酵过程的中后期，由于营养物质匮乏，难以维持菌体细胞进一步生长；另外由于随着菌体细胞浓度升高，减弱了光线穿透能力，影响了光合细菌的生长。
[0004] 有鉴于此，本发明人研究和设计了一种高浓度光合细菌的培养基及其培养方法，本案由此产生。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种高浓度光合细菌的培养基及其培养方法，在培养过程中，补充荚膜红假单胞菌生长的营养增强剂浓缩液，延长荚膜红假单胞菌的生长对数期；在光合细菌四级发酵过程中，每12小时使光照强度逐渐增强；最终制得高浓度的光合细菌。[0006] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题的技术方案是：
一种高浓度光合细菌的培养基，包括以下组分：
醋酸钠5.0 g/L，丙酸钠1.0 g/L, 酵母膏4.0 g/L, 氯化钠2.0 g/L, 磷酸氢二钾0.5 g/L, 磷酸二氢钾 0.5 g/L, 硫酸镁0.5 g/L, 碳酸氢钠2.0 g/L, 硫酸铵 1.0 g/L, 辅助营养液2mL，水998mL，pH 7.0~7.5；其中，辅助营养液为：烟酸胺0.005 g/L，生物素0.001 g/L，泛酸钙0.003 g/L，维生素B1 0.007 g/L，维生素B6 0.007 g/L。
[0007] 一种高浓度光合细菌的培养方法，包括以下步骤：
步骤一、菌种准备：以荚膜红假单胞菌作为培养菌株；
步骤二、发酵培养基制备：按照上述的组分配制培养基；
步骤三、一级种子培养：将荚膜红假单胞菌单菌落接入灭菌过的30mL试管培养基中，橡胶塞密封；在光照培养箱中恒温培养，温度30~35℃，光照强度3000~5000Lx；培养至深棕红色，菌体浓度在109~1010个/mL，结束培养，制得一级种子液；
步骤四、二级种子培养：以一级种子液作为种子液，按照体积比15%~20%的接种量接入灭菌过的1000mL三角瓶培养液中，橡胶塞密封；在光照强度3000~5000Lx下厌氧培养，每日摇荡3~5次；培养至深棕红色，菌体浓度在109~1010个/mL，制得二级种子液；
步骤五、三级种子培养：以二级种子液作为种子液，按照体积比15~20%的接种量接入灭菌的10L细口广口瓶培养液中，橡胶塞密封；在光照强度3000~5000Lx下厌氧培养，每日上下翻转摇荡3~5次；培养至深棕红色，菌体浓度在109~1010个/mL，结束培养，制得三级种子液；
步骤六、四级发酵培养：以三级种子培养液作为种子液，按照体积比15~20%的接种量接入已经通过1%高锰酸钾溶液消毒处理的耐高压、酸碱PE袋中，装液量为200L，袋口采用消毒的尼龙绳扎紧；在光照强度在2000~4000Lx下，采用上下双层光照培养；每6小时进行
值，直取样，通过可见光分光光度计测定10倍稀释发酵液在600nm波长下的吸收值-OD
600nm 值不再增加时终止发酵培养。
至OD
600nm
[0008] 作为实施例的优选方式，在所述四级发酵培养过程中的第36小时、60小时分别补加20倍浓缩发酵液；每次补加浓缩发酵液后，上下震荡培养袋1分钟，继续厌氧光照培养；在发酵过程中的每隔12小时调整光照强度，使光照强度逐渐增强，增强幅度为每次10%~20%。
[0009] 本发明采用塑料袋静置发酵培养光合细菌，在发酵过程中分批次补加营养增强剂浓缩液。采用上下两层光照，并阶梯式增强光照强度，直至菌体浓度不再升高时才终止发酵培养。
附图说明
[0010] 图1 本发明在发酵过程中OD600nm值的变化曲线；其中，对照组：发酵过程中没有补加营养浓缩液，光照强度没有逐渐改变；实验组：按照本发明培养方法进行。
具体实施方式
[0011] 实施例1
一种高浓度光合细菌的培养基，包括以下组分：
醋酸钠5.0 g/L，丙酸钠1.0 g/L, 酵母膏4.0 g/L, 氯化钠2.0 g/L, 磷酸氢二钾0.5 g/L, 磷酸二氢钾 0.5 g/L, 硫酸镁0.5 g/L, 碳酸氢钠2.0 g/L, 硫酸铵 1.0 g/L, 辅助营养液2mL，水998mL，pH 7.0~7.5；其中，辅助营养液为：烟酸胺0.005 g/L，生物素0.001 g/L，泛酸钙0.003 g/L，维生素B1 0.007 g/L，维生素B6 0.007 g/L。
[0012] 实施例2
一种高浓度光合细菌的培养方法，包括以下步骤：
步骤一、菌种准备：以荚膜红假单胞菌作为培养菌株；
步骤二、发酵培养基制备：按照上述的组分配制培养基；
步骤三、一级种子培养：将荚膜红假单胞菌单菌落接入灭菌过的30mL试管培养基中，橡胶塞密封；在光照培养箱中恒温培养，温度30~35℃，光照强度3000~5000Lx；培养至深棕红色，菌体浓度在109~1010个/mL，结束培养，制得一级种子液；
步骤四、二级种子培养：以一级种子液作为种子液，按照体积比15%~20%的接种量接入灭菌过的1000mL三角瓶培养液中，橡胶塞密封；在光照强度3000~5000Lx下厌氧培养，每日摇荡3~5次；培养至深棕红色，菌体浓度在109~1010个/mL，制得二级种子液；
步骤五、三级种子培养：以二级种子液作为种子液，按照体积比15~20%的接种量接入灭菌的10L细口广口瓶培养液中，橡胶塞密封；在光照强度3000~5000Lx下厌氧培养，每日上下翻转摇荡3~5次；培养至深棕红色，菌体浓度在109~1010个/mL，结束培养，制得三级种子液；
步骤六、四级发酵培养：在本公司发明的光照增强装置上进行发酵，以三级种子培养液作为种子液，按照体积比15~20%的接种量接入已经通过1%高锰酸钾溶液消毒处理的耐高压、酸碱PE袋中，装液量为200L，袋口采用消毒的尼龙绳扎紧；在光照强度在2000~4000Lx 下，采用上下双层光照培养；每6小时进行取样，通过可见光分光光度计测定10倍稀释发酵
液在600nm波长下的吸收值-OD
600nm 值，直至OD
600nm
值不再增加时终止发酵培养。
[0013] 作为实施例的优选方式，在所述四级发酵培养过程中的第36小时、60小时分别补加20倍浓缩发酵液；每次补加浓缩发酵液后，上下震荡培养袋1分钟，继续厌氧光照
培养；在发酵过程中的每隔12小时调整光照强度，使光照强度逐渐增强，增强幅度为每次10%~20%。
[0014] 实施例3
每隔六小时进行取样，通过分光光度计对发酵液的10倍稀释液进行OD
600nm
值测定，结
果如图1所示。实验结束后，对照组稀释10倍后的发酵液的OD
600nm
值为1.28。而实验组的
OD
600nm
值为2.57，是对照组的2倍。按照本发明的培养方法发酵，发酵液中的光合细菌浓度将达到20×109个/mL。
[0015] 本发明在培养过程中的第36小时和第60小时，补充荚膜红假单胞菌生长的营养增强剂浓缩液，延长荚膜红假单胞菌的生长对数期。在光合细菌四级发酵过程中，每12小时将光照强度提高10%~20%。采用可见光分光光度计测定10倍稀释发酵液在600nm波长
下的吸收值，即OD
600nm 值。直至OD
600nm
值不再增加时才终止发酵，发酵液中的荚膜红假单胞
菌浓度将达到20×109个/mL。
[0016] 以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
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