（1）通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒；

（2）通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术；

1）质粒DNA的提取：

（1）关于质粒：

质粒是一类存在于几乎所有细菌中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的DNA分子。质粒通常携带有染色体上所不存在的能够表达产生抗生素、耐受重金属等重要性状的基因。细菌质粒的大小范围从1kb至200kb以上不等，且拥有自己的复制起始位点，可不依赖于染色体而进行自主复制。一些小的质粒利用宿主细胞的酶进行复制，而较大的质粒则自身携有复制与编码的有关酶。

（2）一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：

①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；

②收集和裂解细菌；

③分离和纯化质粒DNA。

分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。

（3）碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理：

碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。

在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确；而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，因复性较缓慢且不准确而相互缠绕形成不溶性网状结构。而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿可以抽提纯化上清液中的质粒DNA。

2）质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳：

（1）关于电泳技术：

电泳常用于分离和纯化那些分子大小、电荷性状或分个构象有所不同的生物大分子——尤其是蛋白质和核酸。正因为如此，电泳已成为生物化学和分子生物学中应用最为广泛的技术之一，其中在分子生物学实验中最为常用的是琼脂糖凝胶电泳。

琼脂糖是一种海藻多糖，琼脂糖胶分离范围很大，但其分辨率却相对较低。通过改变琼脂糖凝胶的浓度，应用标准的电泳技术可以分离200到50,000 bp 大小的 DNA 片断。一般琼脂糖胶浓度在0.5％到4％之间，且琼脂糖凝胶浓度越大，凝胶就越硬。较高浓度的琼脂糖胶有利于较小的DNA片断分离，而较低浓度的琼脂糖胶则可以分离较大的DNA片断。

（2）琼脂糖凝胶电泳条带的观察：

通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA的迁移距离。溴酚蓝染料在琼脂糖凝胶的迁移速率大小与300和4000bp大小的双链DNA片断相同。当迁移足够距离后，就可以通过Gelview染色来观察DNA片断。Gelview是一种荧光染料。它可以在做胶时混入其中在电泳时进行染色，也可以待电泳完成后将凝胶浸泡在稀释的Gelview 溶液中进行染色 。但必须将凝胶置于紫外透射仪中才可以对凝胶中的DNA或RNA进行观察。

（3）质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分离：

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液环境中带负电荷，在电场中向正极移动，由于磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以相同的速度向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的构型和大小。具有不同分子质量或者不同构型的DNA分子泳动速率不一样，可以进行分离。

未切割的质粒DNA在其泳道上也许会出现几个条带，之所以这样是由于质粒DNA在琼脂糖凝胶中的迁移距离是由其分子构象及其碱基对大小所决定的。质粒DNA以下列三种主要构象中的任何一种形式存在：

1超螺旋DNA：

尽管质粒通常以开环的形式进行描述，然而在细菌细胞内DNA链即是盘绕在组蛋白周围形成一种致密的结构。这就是所谓超螺旋结构，由于其结构致密，它在凝胶中的泳动速度最快。

2线性DNA：

当DNA损伤在DNA双链相对应的两条链上同时产生切口时，就会出现线性质粒DNA，这种DNA的泳动速率介于超螺旋与切口质粒DNA之间。

③开环DNA：

在质粒DNA复制过程中，拓扑异构酶I会在DNA双螺旋中的一条链中引入一个切口，解开质粒的超螺旋。在质粒分离过程中由于物理剪切和酶的切割作用同样也会在超螺旋质粒中引入切口从而产生松散的开环结构。这种形式的质粒迁移速率最慢，其“松散”的分子形式阻碍了它在琼脂糖凝胶中的运动。

（1）实验仪器（apparatus）：

恒温培养箱（Constant temperature incubator）、恒温摇床（Constant temperature shaking table）、高速离心机（High speed centrifuge）、漩涡振荡器（Vortex mixer）、超净工作台（Bechtop）、高压灭菌锅（Autoclave）、微量加样器（Pipettes）、烧杯（ beaker）、量筒 （graduated cylinder）、 玻璃棒（stir bar）、 微波炉（microwave）、 天平（Pan balance）、电泳梳子（ comb）、电泳槽 （electrophoresis tank）、 电泳器 （Electro-phoresis  System）、 紫外灯（Ultraviolet  transilluminator ）

3）、材料与试剂（Reagents）：

①溶液I（Solution Ⅰ）：

50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L  三羟基甲基氨基甲烷（Tris）Tris-HCl（pH8.0）；10mmol/L  乙二胺四乙酸（EDTA） pH8.0

溶液I可成批配制，每瓶约100ml，10磅高压蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。

②溶液Ⅱ（Solution Ⅱ）：新鲜配制，等体积混合

0.2mol/L  NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）；1%  SDS （可用10％贮存液稀释配制）注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。

③溶液III （Solution Ⅲ，100mL)：加上后混匀会形成絮状沉淀

60mL   5mol/L KAc，

11.5mL  冰醋酸，

28.5mL H2O  （该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L）

④TE液缓冲液：10 mmol/L  Tris-HCl（pH8.0）；1 mmol/L  EDTA（pH8.0）

⑤70% 乙醇；

⑥平衡酚：氯仿  1：1：

将量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24 ml 氯仿和 1 ml 异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。

⑦LB培养基：

胰化蛋白胨  10g

酵母提取物  5g

NaCl        15g

pH          7.0

⑧琼脂糖（Agarose）；

⑨1 liter（升）5×TBE备用溶液（stock solution）：

54g tris base，27.5g 硼酸（boric acid），20ml 0.5 mol/L EDTA , pH 8.0；

⑩6×凝胶加样缓冲液：

0.25% 溴酚蓝（bromophenol blue），40% 蔗糖（sucrose in water）；

另外还有的试剂是：胰RNA酶、DNA Marker、硼酸、Gelview试剂

（2）实验材料：含有pUC19质粒的大肠杆菌等。

1）实验方法步骤

第一部分：质粒DNA的提取及酶切

（1）取1.4 ml含pUC19这里的大肠杆菌培养物于1.5 ml微量离心管中，4 000 r/min 离心2分钟，吸去上清液，并使细胞沉淀尽可能干燥；

（2）加100 l 溶液Ⅰ悬浮细菌沉淀，充分混和均匀，室温放置10 min；

（3）加200 l溶液 Ⅱ（新鲜配制），盖紧管口，轻缓上下4-6次颠倒离心管以混合内容物。将离心管静置冰上5 min（使溶液变透明，粘稠）；

（4）加200 l溶液 Ⅲ（事先冰上预冷），盖紧离心管口后上下轻缓颠倒4-6次，置冰上15 min (溶液出现白色沉淀)；

（5）12 000 rpm离心15 min，转移上清液至另一离心管（弃沉淀）；

（6）向上清液中加入等体积的酚：氯仿（1：1），反复混匀，12 000 rpm离心5min，取上清液移至另一离心管中；

（7）加2倍体积无水乙醇，振荡混匀，静置10 min，12000 rpm离心5－10 min。弃上清液，将离心管倒置于吸水纸，将附于管壁的残余液滴除净。

（8）加200 l 70％乙醇洗涤沉淀物，12000 rpm离心2 min，弃上清液，将沉淀在室温下晾干（或在50℃－60℃的烘箱中也可）。

（9）沉淀加20μl TE, 反复吹打使质粒DNA充分溶解，－20℃保存。

第二部分：质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳

Ⅰ. 凝胶的制备（Preparation of  the gel）

（1）制备1％琼脂糖凝胶：

称取0.5g琼脂糖，放人锥形瓶中，加入50mL的 0.5×TBE 缓冲液，放入微波炉加热至完全溶化，则为0.5％琼脂糖凝胶液（由于蒸发作用，溶解前在容量瓶上作一个记号，溶解后用三蒸水补足）；

(2）制胶器的安装：

①取多功能制胶器，洗净，晾干；

②将多功能制胶器放置于一水平位置，选择12×6cm制胶架，然后选择1.5mm 18teeth的梳子（最大加样量25µl）；

③将所选择规格的梳子插入制胶架的定位槽中；

（3）将熔化的琼脂糖凝胶液转入Gelview专用的三角瓶中，然后加入Gelview 5µl；

（4）将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入所选择的制胶槽内，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)；

（5）待胶凝固后（30-60min），轻轻拔掉梳子，将凝胶盘从制胶槽中取出，放入电泳槽内；

（6）加入电泳缓冲液(0.5×）至电泳槽中；

Ⅱ. 加样(Loading DNA samples)：

用移液缓慢将DNA样品及其经过酶切的质粒DNA样品垂直加入加样孔直至开口下方（记录点样顺序，以便作为对照和分析），各加样量如下：

DNA samples ：15µl            酶切的DNA样品：3µl

 Loading buffer： 2µl          DNA markers ：6µl 

（DNA samples与Loading buffer总共加入20µl）

Ⅲ. 电泳（Gel）：

（1）接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极，DNA片段从负极向正极移动)。保持电压 120V；

（2）当溴酚蓝染料移动到凝胶总长度一半处时，停止电泳；

Ⅳ. Gel Interpretation （凝胶图像解释）：

将电泳后的凝胶放在紫外灯的照射下进行DNA电泳条带的观察，并用凝胶电泳成像系统进行拍照、分析。

2）注意事项

（1）加溶液I后，必须要将菌体悬浮彻底，不得有块状或大颗粒状呈现，是质粒DNA提取的首要关键；

（2）TAE和TBE均为常用的缓冲液。TBE比TAE有相对高的缓冲能力。

（3）加样染料溴酚蓝可与长度约为0.5 kb的DNA一起迁移，可用于指示迁移率最高的片段。

（4）DNA的迁移速率取决于以下因素:

①DNA的分子大小—分子量越小，迁移越快。

②琼脂糖浓度—浓度越低，迁移越快。

③DNA的构象—环状的或带切口环状的DNA通常比线状的DNA迁移要快。

④两个电极之间单位厘米的电压——电压越高，迁移越快。

（5）如果DNA条带不够窄且不够均匀，可能是内以下原因所引起：

①DNA过载   ②电压过高   ③加样孔破损    ④凝胶中有气泡

（6）在紫外灯下观察凝胶电泳所得结果应该戴上防护眼镜，因为紫外线对眼睛有伤害作用；

将电泳后的凝胶放在紫外灯的照射下观察到的和用凝胶电泳成像系统进行拍照得到的DNA电泳条带图如下所示意：

图注：x’：代表经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带；

  x  ：代表未经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带（x相同的互为对照组）；

  marker:DNA相对分子质量标准物。

pUC19质粒DNA标准参照条带图像：

（1）对实验现象的分析及其结论：从上述所示的DNA电泳条带图可以看出：

不管在DNA Sample中还是在经过酶切处理后的DNA样品中均具有电泳迁移速率处于中间的线性质粒DNA。而在此次试验中出现线性质粒DNA是因为pUc质粒DNA在提取的过程中DNA双链在相对应的两条链上同时产生切口。 

这说明质粒制备过程个出现线性DNA说明存在核酸酶污染或实验操作有问题。可能在其中混有少量的蛋白质（图中，位置在marker组最后一电泳条带后方的很可能就是蛋白质组分），或者在实验的提取过程中加入溶液Ⅱ所经历的时间过长，在碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂，从而使提取的质粒DNA样品混入了基因组 DNA。

但是其中各组也存在超螺旋DNA（与marker组对照，电泳速率最快，跑在最前面的）。标号为1、2和3组的电泳条带存在开环质粒DNA（与marker组的最后一条带相比较，同在一条水平线上且较亮的一条条纹即为开环质粒DNA），而且只出现在未经过酶切的质粒DNA Sample中， 这说明在此次实验过程中酶切是彻底的。

从总体上观察，所有电泳条带的亮度并不高，可能是提取的质粒DNA量较少（浓度过低）或电泳前加样量过少所致。

（2）对实验分析及其结论：

①溶液Ⅰ的作用：悬浮大肠杆菌菌体，而且加溶液I后，必须要将菌体悬浮彻底，不得有块状或大颗粒状呈现，是质粒DNA提取的首要关键。且其中含有的溶霉菌可以水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌作用。另外葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+ 和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，在溶液 I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉，从而起到抑制 DNase对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。另外也可保证溶菌酶活性。

溶液Ⅱ的作用：

提供碱性条件，在NaOH与SDS的共同作用下使大肠杆菌瞬间裂解，并变性核DNA。当细胞悬浮于NaOH和十二烷基酸钠（SDS）溶液中使，在高pH（碱性环境）的作用下细胞发生裂解，此外蛋白质和染色体DNA发生变性与细胞碎片一起沉淀下来。这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化。新配制的溶液Ⅱ避免作为最佳溶解细胞的试剂—NaOH接触空气中的CO2过久而减弱了碱性。用不新鲜的0.4 M NaOH，即便有SDS也无法有效溶解大肠杆菌。因此必须使用新鲜的0.4 M NaOH试剂进行配制。

溶液Ⅲ的作用：

该溶液所含有的高浓度钾离子与溶液体系中的十二烷基硫酸钠（即SDS与NaOH所形成的可溶性物质）发生反应形成十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate,PDS），从而将与之结合的绝大部分大肠杆菌蛋白质以及很长的基因组DNA一起沉淀沉淀，与质粒分离开来；另外溶液Ⅲ所含有的醋酸是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀，这样就跟质粒DNA共存了。而且在整个质粒DNA的提取过程中，沉淀DNA时用无水乙醇及在高盐、低温条件下进行都是为了用化学或物理手段将基因组DNA分子和蛋白质发生变性、在体系中的溶解度降低，较充分的分离提纯出实验所需的质粒DNA。

②酚氯仿抽提DNA体系后出现的现象及其成因：

加入苯酚/氯仿/异戊醇，是为了进一步变性和沉淀蛋白。

A．水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液，离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；

B．酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应。而且含质粒DNA的水相会部分进入到酚中，造成损失！

C．添加异戊醇，主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，方便了水相的回收。

③要将DNA保存于TE缓冲液中的原因：

在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。

采用Tris-HCL（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲对时Tris+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCL系统，而TE缓冲液中的EDTA能螯合金属离子，抑制Dnase的活性，更能稳定DNA。

                                          签名：          年   月   日