基因工程是利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程.

现代生物技术的内容：基因工程技术、蛋白质工程技术、细胞（组织）工程技术、酶工程技术、发酵工程技术

2请简述基因工程中使用的主要酶类和它们的功能

性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割  

DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化  

核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 

核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 

核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 

核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 

其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等

3载体必备的功能元件是什么，各有什么功能

 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。 至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。 至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。

4何为α互补，它在载体构建中有何作用

 β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个部分可存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。通过其是否具有β—半乳糖苷酶活性作为构建载体的筛选标志。

β—半乳糖苷酶基因的优点: 

 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观

 α编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性

 α和β链基因的分别表达可使载体小而容量大

5简述利用T7噬菌体启动子的pET系列表达载体的工作原理。

 pET载体及其表达系统pET-5a：在载体的基本结构上加入了T7噬菌体启动子序列及其下游的几个酶切位点。当外源基因插入到这些酶切位点后，就可在特定的宿主细胞中诱导表达。T7噬菌体启动子：只能由T7噬菌体的RNA聚合酶识别并启动转录，而大肠杆菌的RNA聚合酶不能作用于T7噬菌体启动子。用于表达的宿主细胞必须能表达T7噬菌体的RNA聚合酶。常用的pET表达载体的宿主菌：大肠杆菌BL21（DE3）。通过宿主控制T7 RNA聚合酶的量来实现的，即在宿主细胞中引入一个带有T7噬菌体的溶菌酶编码基因的质粒，如pLysS或pLysE，它们分别低量和高量表达T7噬菌体的溶菌酶。该溶菌酶可抑制T7 RNA聚合酶的活性，从而减少在未诱导情况下外源基因的表达。使启动子的控制效应更严谨。在pET载体上装载lacⅠ基因，提高阻抑物的浓度。可利用T7-lac启动子（在T7启动子序列下游装入一个由25bp组成的lacO操纵子序列），当阻抑物结合在lacO位点时，即使存在T7 RNA聚合酶，外源基因也无法表达。只有当诱导物存在时，才能解开T7 RNA聚合酶基因和外源基因表达的双重阻遏。

6请简述PCR引物设计的要点

① 长度：至少 16bp ，通常为 18-30bp ，更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。

② 引物的解链温度：两个引物之间的 Tm 值差异最好在 2-5℃ 。对于小于 20 个碱基的引物其 Tm 值可用简易公式计算，即 Tm=4（G+C）+2（A+T）。 对于 14-70 个核苷酸的引物可用以下公式计算。

    Tm=81.5+16.6（1g[K+]）+0.41（G+C）%-（675/N）

    N 表示引物的核苷酸数目， [K+] 表示单价离子即钾离子的浓度。

③ 避免引物内部或引物之间存在互补序列（3个碱基），从而减少引物二聚体的形成以及引物内部二级结构的形成。

④ G+C 含量：尽量控制在 40% 至 60% 之间， 4 种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及 T 在 3' 末端的重复排列。

⑤ 引物的 3' 末端最好是 G 或 C ，但不要 GC 连排。

7请简述DNA诱变的种类和特点

一、 随机诱变 特点：不需要有序列针对性的设计，引起突变的位置及性质是随机的。

随机诱变的关键和策略，选择合适的突变频率：目的基因中有1.5-5个碱基发生碱基替换时，诱变结果最理想。根据研究目的对突变体进行定向选择或筛选。做定向进化或试管进化。

1、错误渗入诱变

指在体外DNA扩增过程中，使用具有错配倾向的DNA聚合酶以及反应条件，使碱基错误渗入到新合成的基因中。

2、盒式诱变

包含简单盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。

简单盒式诱变：用性内切酶去掉特定的片段，然后用含有突变的序列取代。

若使用含随机突变的混合寡核苷酸，则可在限定区域内引入大量的随机突变。

3、增变菌株的诱变作用

4、化学诱变

用化学诱变剂处理双链DNA片段，将发生随机突变的片段群体克隆到合适的宿主中可构成一个重组突变体库。常用的化学试剂有：亚、羟胺、亚硫酸氢盐或肼。

8某研究者通过蛋白质分离纯化的方法，得到了某一真核生物蛋白质并测定了该蛋白质N端的氨基酸序列，请叙述如何综合利用分子生物学和基因工程技术得到该蛋白质相应的cDNA基因序列？

提取总RNA，设计引物对mRNA进行RT-PCR，连接到载体，进行质粒转化，阳性克隆筛选，重组质粒鉴定，原核表达，测序。

上游引物设计：可以根据蛋白质N端的氨基酸序列可以得到几段DNA序列，则是与基因5’的DNA序列，可根据这一段序列设计基因的上游引物。由于不同的密码子可能编码同一个氨基酸，得到的5’的DNA序列会有好几种，设计的引物也对应有好几种，再则氨基酸那里不同的基因密码子的偏好性会不同，可以根据该分离的蛋白质氨基酸密码子的偏好性选择设计好了的合适的上游引物。

下游引物：mRNA的poly-A尾巴对于的olig-dT

利用上述引物对mRNA进行逆转录测序得到的就是cDNA基因序列有好几条，然后到genebank中进行比对筛选出引物那段序列一致的cDNA序列，那就是要的蛋白质相应的cDNA序列。下载本文