1 概述：

本本法是用于建立微生物检查法时，根据中国药典2005年版二部分要求，需对细菌、霉菌及酵母菌的计数方法进行验证。故计划于2006年9月份对细菌、霉菌及酵母菌的计数方法进行验证。

2 原理：

根据不同的样品，制备成供试液，再将规定量的供试液通过膜微过滤系统真空抽滤，将滤膜进行培养，对形成的菌落计数，或通过采用平皿法对形成的菌落计数，从而了解供试品的微生物含量。

3 菌种：

大肠埃希菌        [CMCC（B）44102]

金黄色葡萄球菌    [CMCC（B）26003]

枯草芽孢杆菌     [CMCC（B）65301]

白色念珠菌        [CMCC（B）98001]

黑曲霉            [CMCC（B）98003]

4 培养基：

营养琼脂培养基                

改良马丁琼脂培养基                

5 试剂：

pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液                 

0.9%无菌氯化钠溶液                                

6 设备：

MILLPORE 微膜过滤系统

7  检测方法：

7.1菌液制备

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至营养琼脂培养基中培养37℃培养18-24小时，用0.9%无菌氯化钠溶液将培养物制备成菌悬液，用细菌比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，经梯度10倍稀释至10-5-10-7，约为50-100CFU/ml，供活菌计数及验证试验用。

接种白色念珠菌新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中25-28℃培养18-24小时，用0.9%无菌氯化钠溶液将培养物制备成菌悬液，用细菌比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，经梯度10倍稀释至10-5-10-6，约为50-100CFU/ml，供活菌计数及验证试验用。

接种黑曲霉孢子液至改良马丁琼脂培养基中，经25℃培养5-7天，加入3-5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸取孢子悬液，用细菌比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，经梯度10倍稀释至10-4，约为50-100CFU/ml，供活菌计数及验证试验用。 

7.2活菌计数 

分别取上述大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌10-5-10-7稀释液各1ml加入平皿，再用不超过45℃的营养琼脂培养基20ml注皿，每个菌株各测定2皿，30-35℃培养48小时，计算菌落数。

分别取上述白色念珠菌10-5-10-6稀释液、黑曲霉10-4稀释液各1ml加入平皿，再用不超过45℃的琥珀红琼脂培养基20ml注皿，每个菌株各测定2皿，23-25℃培养逐日观察计数。

7.3供试液的制备

取供试品10ml加入到pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90ml中，混匀后即为1：10供试液。取上述1：10供试液，加入到pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90ml中，混匀，作为1：100供试液。

7.4回收率的测定

薄膜过滤法：

7.4.1.试验组：取适量无菌注射用水注入开放式滤杯中以湿润滤膜，后取1：100供试液100ml、50-100cfu试验菌同时加入滤杯中，抽滤，后将滤膜夹入到适宜试验菌培养的培养基平皿中，共制备两张滤膜，置规定温度培养规定时间，逐日观察结果。

7.4.2.菌液组：取适量无菌注射用水注入开放式滤杯中以湿润滤膜，后取灭菌pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml、50-100cfu试验菌同时加入滤杯中，抽滤，后将滤膜夹入到适宜试验菌培养的培养基平皿中，共制备两张滤膜，置规定温度培养规定时间，逐日观察结果。

7.4.3.供试品对照组：取适量无菌注射用水注入开放式滤杯中以湿润滤膜，后取1：100供试液100ml加入滤杯中，抽滤，后将滤膜夹入到适宜试验菌培养的培养基平皿中，共制备两张滤膜，置规定温度培养规定时间，逐日观察结果。

8 验证内容、方法及限度：

8.1 设备确认

8.1.1 检查验证所使用的设备的检定状，并按下列方式记录检查结果。

按如下公式计算试验组的加菌回收率：

                       试验组的平均菌落数—供试品对照组的平均菌落数

试验组的加菌回收率＝                                               ×100%

                                   菌液组的平均菌落数

8.2试验限度

经过三次的平行试验该供试品接种5株阳性试验菌株，实施薄膜过滤法检查的加菌回收率均不低于70％

9 验证参加人员

本验证方案报质量保证部门复核并审核。下载本文