北 京 农 学 院 学 报
JOU RNAL OF BEIJING UNIVERSIT Y OF AGRICU LTU RE
Vo l.24,N o.4
Oct.,2009
收稿日期:2009-03-10;修订日期:2009-05-20
作者简介:杨柳,硕士研究生,实验师,研究方向为分析化学和色谱仪器分析;通讯作者:路苹
糖类物质测定方法评价
杨 柳,王建立,王淑英,路 苹*
(北京农学院农业应用新技术北京市重点实验室,北京102206)
摘 要:糖类物质是生物样品中的重要组成部分,在生命代谢中起着主要作用。糖类物质测定在生命科学研究领域中有着重要意义。笔者论述糖类物质测定的主要方法,评价各种糖类物质测定方法的技术特点。关 键 词:糖类物质;测定方法;评价
中图分类号:Q53 文献标志码:A 文章编号:1002-3186(2009)04-0068-04
A Review on Determination Methods of Sugar Content
YA NG Liu,WAN G Jian -li,WANG Shu -ying,LU Ping *
(N ew T echno lo gical L abo rato ry in Ag riculture A pplication in Beijing ,Beijing U niver sity o f Ag icultur e,Beijing 102206,China)Abstract :Sug ar co ntent det erminatio n is impo rtant in life science study.T his paper rev iews methods used in the determinatio n of sug ar co ntent.T he advantag e and suit abilit y among the methods are discussed.Key words :suga r content ;det erminatio n methods;r eview 碳水化合物统称为糖类物质,是由碳、氢、氧三种元素组成的一大类化合物,也是蛋白质、脂肪代谢的必要物质,并且是人体必需重要营养元素之一。碳水化合物的含量测定是生物化学和其他生命学科、食品检验、临床检验、疾病诊断和质量检验中的一项重要工作。了解掌握糖类物质的各种测定方法的原理和技术特点,对在科研实际工作中选择适宜的分析方法具有重要的指导意义。
碳水化合物种类较多,按其组成特征可分为单糖、低聚糖(寡糖)和多糖三大类。由糖苷键结合的糖链,超过10个以上的单糖组成的聚合糖称为多糖,低于10个单糖的短链聚合糖称为寡糖;按理化性质可分为还原糖和非还原糖,可溶性糖和不可溶性糖;转化糖等。糖类分子中含有游离醛基或酮基的单糖和含有游离醛基的双糖都具有还原性,葡萄糖、果糖、乳糖和麦芽糖等都是还原糖,其他双糖(如蔗糖)、低聚糖乃至多糖(如糊精、淀粉等),其本身不具有还原性,属于非还原性糖,但非还原性糖都可以通过水解而生成还原性的单糖,测定水解液的还原糖就可以求得相应糖类的含量。因此,单糖是糖类物质的基础,通过测定单糖的含量,可相应换算为总糖、双糖及多糖。单糖具有还原性,还原糖测定是一般糖类测定的基础[1]。糖类物质测定方法很多,主要方法包括有容量法、分光光度法、酶分析法、色谱法和旋光法等。
1 容量法
1.1 碱性铜盐定糖法的测定原理和方法特点 碱性铜盐方
法主要用于测定还原糖。碱性铜盐溶液即为费林氏试剂,由碱性酒石酸铜甲、乙液组成。甲液为硫酸铜溶液,乙液为酒石酸钾钠等配成的溶液。在加热条件下,还原糖能将碱性酒石酸铜溶液中的Cu 2+ Cu + Cu 2O 。
1.1.1 直接滴定法的测定原理和方法特点 将一定量的碱
性酒石酸铜甲液、乙液等量混合,立即生成天蓝色的氢氧化
铜沉淀,该沉淀很快与酒石酸钾钠反应,生成深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜络合物。酒石酸钾钠铜具有氧化性,在加热条件下,能将还原糖氧化成醛酸,本身还原为氧化亚铜沉淀。反应终点用次甲基蓝指示,次甲基蓝是一种氧化还原指示剂,其氧化型为蓝色,还原型为无色,它的氧化能力比Cu 2+弱,待还原糖将二价铜全部还原后,稍过量的还原糖则可把次甲基蓝还原,溶液由蓝色变为无色,即为滴定终点。试样经除去蛋白质后,在加热条件下,以次甲基蓝作指示剂,滴定标定过的碱性酒石酸铜液(用还原糖标准溶液标定碱性酒石酸铜溶液),根据样品液消耗体积计算还原糖量。 直接滴定法是GB/T 5009.7-1985方法中的第二法和GB/T 5009.7-2003方法中的第一法。它是在蓝-爱农容量法的基础上发展起来的,其方法特点是试剂用量少,操作和计算都比较简便、快速、滴定终点明显[2]。但因色素干扰影响滴定终点的观察,故不适于检测深色样品。臧瑾康等人改进还原糖测定的国标方法,用费林试剂(酒石酸钾钠铜络合物)的深蓝色溶液的颜色消失至呈K 2F eCu(CN)6的浅黄色溶液作为终点,其方法与国标直接滴定法无显著性差异,减少终点误差,简化操作[3]。
直接滴定法所用的碱性酒石酸铜溶液配制方法不同于蓝-爱农容量法和高锰酸钾滴定法,配制方法:甲液15.00g 硫酸铜及0.05g 次甲基蓝,溶于水中并稀释至1000mL 。乙液50.00g 酒石酸钾钠及70g 氢氧化钠溶于水中,再加入4g 亚铁,完全溶解后稀释至1000mL 。亚铁的作用是与Cu 2O 生成可溶性络合物,而不再析出红色沉淀,消除沉淀对观察滴定终点的干扰。该法滴定操作条件要求很严,滴定必须在沸腾条件下进行,测定结果与试验条件有关,如试剂碱度、热源强度、加热时间和滴定速度等。
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淀,加入过量的酸性硫酸铁溶液,氧化亚铜被氧化成铜盐而溶解,硫酸铁被还原为亚铁盐。以高锰酸钾溶液滴定氧化作用后生成的亚铁盐,根据滴定时高锰酸钾溶液消耗量,计算氧化亚铜含量。再从 相当于氧化亚铜质量时葡萄糖、果糖、乳糖、转化糖的质量表 中查出与氧化亚铜相当的还原糖量,即可计算出样品中还原糖含量。
高锰酸钾滴定法又称Bertrand法,是G B/T5009.7-1985方法中的的第一法和GB/T5009.7-2003方法中的第二法。该法的准确度和重现性都优于直接滴定法,方法的准确度高,重现性好,有色样液也不受[2]。但流程长、步骤多、操作复杂、费时,需使用高锰酸钾法糖类检索表[4]。
高锰酸钾滴定法所用的碱性酒石酸铜溶液配制方法与直接滴定法不同,配制方法如下:甲液34.639g硫酸铜加适量水溶解,加0.5mL硫酸,并稀释至500mL。乙液173.00 g酒石酸钾钠及50g氢氧化钠加适量水溶解,并稀释至500 mL。测定必须严格按规定的操作条件进行。
1.1.3 萨氏法的测定原理和方法特点 将一定量的样液与过量的碱性铜盐溶液共热,样液中的还原糖定量地将二价铜还原为氧化亚铜。氧化亚铜在酸性条件下溶解为一价铜离子,同时碘化钾被碘酸钾氧化后析出游离碘。一价铜将碘还原为碘化物,而本身从一价铜被氧化成二价铜。剩余的碘与硫代硫酸钠标准溶液反应。根据硫代硫酸钠标准溶液消耗量可求出与一价铜反应的碘量,从而计算出样品中还原糖含量。
萨氏法又称为So mog yi法,是一种微量法,检出量在0.015~3mg,灵敏度高,重现性好,结果准确可靠。萨氏法所用的碱性铜盐溶液,主要由硫酸铜-磷酸盐-酒石酸盐组成。萨氏试剂用N a2HP O4部分代替NaO H,使试剂碱性减弱,因此配成混合溶液也可以保存较长时间。萨氏试剂中大量的Na2SO4可降低反应液中的溶解氧,避免生成的Cu2O重新氧化。应严格控制操作条件,萨氏试剂的标定和样品测定在同一条件进行。自1933年萨氏法由Somo gy i提出以来,已有多种萨氏改良法的报道。潘能斌改良的萨氏试剂省去酒石酸钾钠的标定步骤,并具有较好的精密度和准确度[5]。1.1.4 蓝-爱农法的测定原理和方法特点 用样品试液滴定一定量、煮沸的碱性酒石酸铜溶液,以次甲基蓝为指示剂,达到终点时,稍微过量的样品试液将蓝色的次甲基蓝还原为无色的隐色体,而显出氧化亚铜的鲜红色沉淀。根据试液的用量,查蓝-爱农法专用检索表,求得样品中还原糖的含量。蓝-爱农法又称L ane-Eynon M ethod,准确度高、重现性好,是一种快速简单的方法。许多国家和国际组织把该法定为测定还原糖的标准分析方法。但该法试剂、操作要求严格,终点不易判断。
该法所用的碱性酒石酸铜溶液同高锰酸钾滴定法。还原糖与碱性酒石酸铜溶液的反应不符合等摩尔关系,不能用化学方程式计算。本法对滴定操作条件要求很严,要求滴定在沸腾条件下进行,样液必须在2min内加热至沸,总煮沸时间在3min内完成,其中维持沸腾2min,然后以1滴/2s 的速度滴定至终点。
1.2 碘量法定糖的测定原理和方法特点 含有游离醛基的糖(葡萄糖)和半缩醛羟基的糖(乳糖、麦芽糖),于碱性溶液中在碘的作用下,可被氧化为相应的一元酸。由于加入的碘与氢氧化钠都是过量的,两者作用生成次碘酸钠残留在反应液中,当加入盐酸使反应液呈酸性时析出碘。用硫代硫酸钠应式进行定量计算,而不用经验检索表。
碘量法可用于醛糖和酮糖共存时单独测定醛糖,适用于各类食品,如硬糖、异构糖、果汁等样品中葡萄糖含量的测定。碘量法分为常量法和微量法,主要差别在于测定时样液用量、试剂浓度及用量不同,常量法样液用量20~25mL,样液含醛糖0.02%~0.45%;微量法样液用量5mL,检出量为0.25~1mg[2]。
碘量法自1918年创始以来已经历多次改良,主要在碱性试剂的选择、反应体系的碱度、反应温度等方面进行改进。其目的一是防止酮糖的氧化,降低共存的酮糖的影响;二是使碱性条件下醛糖与碘的反应完全按反应式进行,以便于计算。
1.3 铁法定糖的测定原理和方法特点 还原糖在碱性溶液中将铁还原为亚铁,本身被氧化为相应的糖酸。剩余的铁在乙酸的存在下,与过量的碘化钾作用析出碘。析出的碘用硫代硫酸钠标准溶液滴定。由于反应是可逆的,为了使反应顺向进行,用硫酸锌沉淀反应中所生成的亚铁。还原糖量与硫代硫酸钠用量之间不符合等摩尔关系,不能根据反应式直接计算出还原糖含量。首先计算出氧化还原糖时所用去的铁的量,再通过查经验表即可查得试样中的还原糖的百分数。
铁法滴定终点明显,准确度高,重现性好,适用于各类食品中还原糖的测定。是粮食、油料等样品中还原糖测定的国家标准分析方法(G B/T5513-1985)。
薄海波研究发现,该法滴定速度的控制十分关键,滴定太快会使结果偏低,太慢会使结果偏高[6]。
2 分光光度法
2.1 蒽酮法定糖的测定原理和方法特点 糖类(包括多糖)在硫酸作用下,脱水生成糠醛或羟甲基糠醛,生成的糠醛或羟甲基糠醛与蒽酮脱水缩合,生成蓝绿色的糠醛衍生物,当糖的量在20~200mg范围内时,其呈色强度与溶液中糖的含量成正比,故可比色定量糖的含量。在620nm波长处有最大吸收,利用标准曲线计算得出样品中糖含量。
蒽酮法是微量法,灵敏度高,试剂用量少,最小检出量30 g[7]。当样品中有较多含色氨酸的蛋白质时,反应不稳定,呈红色[8]。蒽酮法按操作的不同可分为几种,主要区别在于蒽酮试剂中硫酸的浓度、取样液量、蒽酮试剂用量、蒽酮浓度[9]、沸水浴中反应时间、室温显色时间[10]、水浴温度[9]、外源加热与否[9-11]。
2.2 3,5-二硝基水杨酸法定糖的测定原理和方法特点 在碱性条件下,还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热,3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质),还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成正比例关系,在540nm波长下测定棕红色物质的消光值,利用标准曲线计算得出样品中还原糖含量。
3,5-二硝基水杨酸法适用于各类样品中还原糖的测定,操作简便、快速、灵敏度高、杂质干扰较小[12],但灵敏度低于蒽酮法。分析结果与直接滴定法基本一致。尤其适用于大批样品的测定。
显色时煮沸时间应控制在6min左右[12];齐香君等学者对其吸收光谱的测定研究发现,生成的氨基化合物在483 nm处有最大吸收,并且测量的相对误差为2.2%[13]。
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北 京 农 学 院 学 报第24卷
2.3 2,4-二硝基酚法定糖的测定原理和方法特点 2,4-二硝基酚的碱性溶液与还原糖在加热时发生从浅黄色到橙色的氧化还原反应,在480nm波长处有最大吸收峰,且在一定的还原糖浓度范围内与还原糖含量呈正相关。由标准曲线的线性回归方程可求出参加显色反应的还原糖含量。
2,4-二硝基酚法简便、快速、准确、重现性好、灵敏度高、计算简单[14]。
2.4 砷钼酸法定糖的测定原理和方法特点 还原糖在碱性环境及有酒石酸钾钠条件下加热,可以定量地还原二价铜离子为一价铜离子,产生砖红色的氧化亚铜沉淀,其本身被氧化。氧化亚铜在酸性条件下,可将钼酸铵还原,还原型的钼酸铵再与砷酸氢二钠起作用,生成一种蓝色复合物即砷钼蓝,其颜色深浅在一定范围内与还原糖的含量(即被还原的氧化亚铜量)成正比,用标准葡萄糖与砷钼酸试剂作用,制作标准曲线,就可测得样品中还原糖含量。检测波长为620 nm[7]。
砷钼酸法的测定范围在25~200 g,快速省时,操作简便,试剂消耗少,方法灵敏度高,可用于微量测定[4]。黄婷则选择560nm的检测波长,其铜试剂配制中的无水硫酸钠用量少于文献[7]方法的三分之一,加热时间也长[4]。
2.5 EDTA-C u配合物光度法定糖的测定原理和方法特点 Cu2+被还原糖还原成Cu+,碱性条件下形成Cu(O H)沉淀,加热进一步形成溶解度更低的Cu2O沉淀,加入EDT A络合剂可防止生成Cu(O H)2沉淀而降低与还原糖的反应速度, ED T A-铜配合物浓度随着与还原糖反应的进行而降低,其吸光度相应降低,通过检测配合物的吸光度即可对还原糖进行定量测定,在pH4~11时,DT A-铜配合物的最大吸收波长为732nm[15]。
DT A-Cu配合物光度法使用的试剂易得、性质稳定、操作简便、灵敏度高,适于长期大批量分析。在H CO-3-CO2-3
缓冲介质中,配合物的吸光度与还原糖在0.77~16.1mg范围内有很好的线性关系[15]。
2.6 紫外分光光度法定糖的测定原理和方法特点 蔗糖在酸性条件下,沸水浴加热,能很快水解生成葡萄糖和果糖。继续加热葡萄糖不会被破坏,而果糖被破坏,其破坏产物在285nm处有最大吸收[16]。占达东则报道果糖在盐酸作用下最大吸收波长在291nm[17]。紫外分光光度法的线性范围为0.27~31.2 g/mL[16]。
2.7 原子吸收间接法定糖的测定原理和方法特点 采用国标法费林氏滴定法的原理,样品中的各种糖类经酸水解均转化为还原塘,不采用滴定法,而是将样液与过量的碱性铜盐反应,使产生沉淀,然后取上清液直接利用原子吸收分光光谱仪测定留存在溶液中的剩余铜含量,通过标准曲线计算糖的含量。
原子吸收间接法适于批量测定,较化学法简便、快速。方法的相对标准差低于3%[18-19]。方法简单易行,线性关系良好,与国标费林氏滴定法比较,结果基本一致[20]。无需过滤、离心,只吸取上清液即可上机测定。
分光光度法还有费林试剂比色法[7,21]、间苯二酚法比色[22-23]、苯酚-硫酸法比色[24]、邻甲苯胺法比色[25]、2,4,6-三硝基酚比色法[26]、磷钼蓝比色法[27]、磷钼酸比色法[28]、咔唑-半胱氨酸比色法[2]和流动注射分析法[29]等。
3 酶分析法
3.1 酶-比色法定糖的测定原理和方法特点 葡萄糖氧化酶在有氧条件下,催化 -D-葡萄糖(葡萄糖水溶液状态)氧化,生成D-葡萄糖酸- -内酯和过氧化氢,受过氧化物酶催化,过氧化氢与4-氨基安替比林和苯酚生成红色醌亚胺。红色醌亚胺是一种红色染料,在中性条件下很稳定[30],在波长505nm处测定醌亚胺的吸光度,可计算出食品中葡萄糖的含量。酶-比色法属国家标准分析法(GB/T16285-1996),最低检出限量为0.01 g/mL,为仲裁法。由于葡萄糖氧化酶具有专一性,只能催化葡萄糖水溶液中 -D-葡萄糖被氧化,不受其他还原糖的干扰,因此测定结果较直接滴定法和高锰酸钾法准确。
3.2 酶-电极法定糖的测定原理和方法特点 葡萄糖氧化酶在有氧条件下催化 -葡萄糖(葡萄糖水溶液状态)氧化,生成D-葡萄糖酸- -内酯和过氧化氢。生成的过氧化氢与过氧化氢电极接触产生电流。该电流值与 -D-葡萄糖的浓度呈线性比例,在酶电极葡萄糖分析仪上直接显示葡萄糖含量。酶-电极法属国家标准分析法(G B/T16285-1996),最低检出限量为1.0mg/100mL,为快速法。由于葡萄糖氧化酶具有专一性,只能催化葡萄糖水溶液中 -D-葡萄糖被氧化,不受其他还原糖的干扰,因此测定结果较直接滴定法和高锰酸钾法准确。
4 色谱分析法
4.1 高压液相色谱法的测定原理和方法特点 糖的高效液相色谱分析法主要有两种,一种是使用化学键合固定相,流动相用乙腈和水的混合物,以单糖、双糖、三糖、多糖的顺序依次洗脱出峰;另一种以阳离子交换树脂或凝胶作为固定相,流动相用水,以多糖、三糖、双糖、单糖顺序依次洗脱出峰。应用液相色谱法分析糖类,通常采用示差检测器进行定性定量[31]。
4.1.1 反相化学键合固定相色谱体系定糖法的测定原理和方法特点 样品经适当的前处理,用0.45 m微孔滤膜过滤后,注入反相化学键合相色谱体系,用乙腈和水作为流动相,糖类分子按其分子量由小到大的顺序分离洗脱,经示差折光检测器检测,得到各个糖组分的峰面积。与标准样品的色谱图比较,根据峰的保留时间定性,根据样品峰面积与已知浓度的标准样品峰面积,得出试样中糖的含量。
反相化学键合固定相色谱体系定糖法的通用工作条件:色谱柱: Bonda pak Carbohy dr ate(4mm 300mm);流动相为乙腈 水(80 20);流速2.5mL/min;进样量20 L;柱温为室温;检测器为示差折光检测器。该法可以在15min内完成5种糖的分离,精密度和准确度都很好,变异系数小于2%。该法只能采用外标和内标法进行定量计算。
4.1.2 凝胶固定相色谱体系定糖法的测定原理和方法特点凝胶固定相分离糖组分的基本原理为分子筛效应[32]。样品经适当的前处理,用0.45 m微孔滤膜过滤后,注入凝胶柱色谱体系,用超纯水作为流动相。分子量大的糖分子不能渗入多孔凝胶颗粒内部,只能沿颗粒间的孔隙向下流动,受到的阻滞作用小,流程短,先被洗脱出凝胶柱;而分子量小的糖分子可渗入多孔凝胶颗粒内部,受到的阻滞作用大,流程长,后被洗脱出凝胶柱。经示差折光检测器检测,得到各个糖组分的峰面积。
凝胶固定相色谱体系定糖法的通用工作条件:色谱柱为Sug arP ark (6.5mm 300mm);流动相为超纯水;流速0.4 mL/min;进样量20 L;柱温85.5 ;检测器:示差折光检测器。该法操作简便、省时、准确度高,即可采用外标法计算各个糖组分的含量,也可以采用归一化法进行定量。
4.2 气相色谱法的测定原理和方法特点 糖类分子间引力一般较强,挥发性弱,故不能直接进行气相色谱分析。但把糖制成某种具有挥发性的衍生物,就可以用气相色谱法进行2009年第4期杨柳等:糖类物质测定方法评价71
分离定量,分析中常用衍生物有:三氯(T M S)衍生物、三氟乙酰(T EA)衍生物、乙酰衍生物和甲基衍生物等。其中最常用的是前两种。
样品经处理后,进行衍生使之生成挥发性衍生物,然后注入气相色谱仪,在一定色谱条件下进行分离,用火焰电离检测器检测,得出色谱图。与标准样品的色谱图比较,根据峰的保留时间定性,根据样品峰面积与已知浓度的标准样品峰面积,得出试样中糖的含量。
气相色谱体系定糖法的工作条件:色谱柱为3%Silicone DCQF-1,chr omoso rb W(AW,DM OS)60~80目。柱温120~240 ;进样口、检测器温度250 ;升温速度6 / min。氮气流量60mL/min;氢气流量50mL/min;空气流量1L/min。气相色谱法的样品前处理操作程序较为复杂、繁琐、费时。脂肪含量高的样品,应先用正己烷脱脂。含脂肪较低的样品不必脱脂。淀粉含量较高的样品应该用80%乙醇提取,一般样品可用水提取。
定糖的色谱分析法还有离子色谱法[2]和气质联用及毛细管气相色谱法[33]等。胡磊等采用气质联用及毛细管气相色谱法分析植物组织中的海藻糖[34],获得较好的试验结果。
4.3 薄层层析定糖法(TLC)的测定原理和方法特点 薄层层析定糖法使用的是硅胶G玻璃板,待分离糖样品点在薄层板一端,然后用适宜的溶剂展开,从而使各组分得到分离。糖在硅胶G薄层上的移动速度与糖的相对分子质量和羟基数有关,经过适当的溶剂展开后,糖在薄板上的移动速度是单糖>双糖>三糖>四糖,戊糖>己糖,酮糖>醛糖。
测糖常用的层析溶剂有氯仿 甲醇、乙酸乙酯 吡啶 水和正丁醇 乙醇 水等,常用的显色剂有苯胺-二苯胺-磷酸、氨-银和苯胺-邻苯二甲酸等。层析分离开的糖组分显色后与标准糖的R f值比较进行定性分析,用斑点面积定量法、薄层层析扫描法进行定量分析。也可以定量点样,将显色后的斑点用小刀刮下收集在试管里,用有机溶剂溶解后用分光光度计测定吸光度,定量计算。
薄层层析定糖法层析时间短,可以分离多种糖组分,样品用量可少(微克级)、可多(高达500mg),与纸层析相比要灵敏10~100倍,观察结果方便,设备简单[34]。
5 旋光法
葡萄糖、果糖、麦芽糖及乳糖等还原糖分子中具有不对称碳原子,故有旋光性。用旋光仪测定旋光度,在一定的条件下,旋光度的大小与试样中这些还原糖含量呈线性关系。 旋光法简单、快速,常用于商品葡萄糖、果糖、麦芽糖等的测定。本法适合于纯度较高的糖溶液测定。
6 结 语
容量法为常规的分析方法,其中较多方法是在碱性铜盐方法基础上发展起来的,准确度高、重现性好,直接滴定法和高锰酸钾法是国家标准方法,但步骤多、操作复杂、费时。分光光度法种类很多,准确度高、重现性好、操作简便、快速。酶分析法属国家标准分析法,适于葡萄糖测定,测定结果较直接滴定法和高锰酸钾法准确。色谱分析法可以对各种糖进行分离定量,准确度和精密度均较高。旋光法比较简便,适于特定的试样或生产过程的技术监控。在科学研究、试验和样品检测工作中可选用适宜的测定方法。
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