2009-11-27 21:50

操作步骤

(1) 准备细胞 

取出一块细胞培养板，每个孔大约传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀）。每个孔的细胞铺成单层大约60％丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用）。

细胞对照选取16个孔即可。滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔。也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。

(2) 稀释待测病毒液。

A法为参考书上标准的操作方法

B法参照书将液体量减少后的结果

病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清。

A向每支试管中加入1.8ml病毒稀释液。向1号试管中加入0.2ml病毒，依次10倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管。

B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10-1，10-2…10-10等)，根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。首次滴定可以多稀释几个滴度。

根据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种4孔，则每个稀释度配500µl，即10-1为50µl加入450µl的孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各配制1ml，即10-1为100µl加入900µl孵育液中。若接种8个孔，则相应增加液体量。上述的配液并不是固定不变的，可以根据接种的量自行调整。

【！此步操作注意事项：

1）建议每个稀释度接种8个孔，若要统计分析则还要增加至16个孔。

2）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。

2）此过程中需要使用加样器和tip头。使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）。】

(3) 接种

取细胞培养板，用多道加样器（又称排）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100µl，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度（10-1，10-2 ）到原液加样。【切记：设置正常的细胞对照。每次实验要重复4次，计算标准差。】

37℃CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔），加入维持液200µl继续在37℃ CO2培养箱中培养。

(4) 培养

将培养板放置于CO2培养箱。培养温度     ，培养    天。

(5) 测定结果

取出培养板，显微镜下观察细胞病变。

计算方法

1) Spearman-Karber 法

    LgCCID50 /0.2ml= - （X0 - d/2 + d×∑R1/N1）    

     X0 = 全部病变最低稀释度对数

     d = 稀释因数对数

     N1 = 每个稀释度所种的孔数

     R1 = 病变孔数                       

∑ = 积和 

LgCCID50 /ml = LgCCID50 /0.2ml +0.7

2) Reed-Muench法

观察CPE, 找出能引起半数细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数，按计算出该病毒液的TCID50