V o l .14　N o.4

　2001年8月

Jou rnal of M edical Po stgraduates

A ug .2001

不同传染性腔上囊病病毒株结构

蛋白表达差异性研究

周宗安1,　王永山1,　邓小昭1,　振宇1,　高　健1,　张建昌1,　罗函禄2

(1.南京军区联勤部军事医学研究所,江苏南京210002;2.江苏省农科院畜牧兽医研究所,江苏南京210014)

摘要:　目的:了解不同传染性腔上囊病病毒株(I CBDV )结构蛋白表达的差异。　方法:将在不同时间、地域,从鸭、麻雀及传染性腔上囊病发病鸡群中获得的18株I CBDV ,分别用SPF 鸡、鸡胚和鸡胚成纤维细胞增生,经氯仿处理后,采用聚乙二醇沉淀、超速离心和不连续蔗糖密度梯度离心的方法纯化病毒,并对纯化病毒进行SD S 2PA GE 分析。　结果:病毒主要分布于40%蔗糖层;鸡源、鸭源、麻雀源I CBDV 在SD S 2PA GE 中均出现5条特异的蛋白带,各蛋白带的电泳迁移率毒株间差异不明显;15株鸡源I CBDV 结构蛋白V P 2在不同毒株表达量有较大差异。　结论:不同传染性腔上囊病病毒株结构蛋白V P 2表达量存在差异。关键词:　传染性腔上囊病病毒;　结构蛋白V P 2;　差异

中图分类号:　S 852.65　　　文献标识码:　A 　　文章编号:　100828199(2001)0420285204Ξ

Study on the diversity of expression of structural protei n among different i n fectious cloacal bursal disease viruses

ZHOU Zong 2an ,W AN G Yong 2shan ,D EN G X iao 2zhao ,D I AO Zhen 2yu ,

GAO J ian ,ZHAN G J ian 2chang ,LU O H an 2lu

(1.M ilita ry M ed ica l Institu te of N anj ing M ilita ry R eg ion ,N anj ing 210002,J iang su ,Ch ina ;　2.Institu te of A n i m a l H usband ry and V eterina ry S cience ,J iang su A cad e m y of A g ricu ltu ra l S ciences ,N anj ing 210014,J iang su ,Ch ina )

Abstract :　O bj ectives :To investigate the diversity of exp ressi on of structu ral p ro tein am ong differen t infecti ou s cloacal bu rsal disease viru ses (I CBDV ).　M ethods :E igh teen strain s of I CBDV from duck ,sp arrow and infected ch icken flock s in differen t p eri ods and regi on s w ere p rop agated in SPF ch icken ,em b ryo and em b ryo fib rob last (CEF )resp ectively .T he viru ses w ere p u rified by ch lo rofo rm ex tracti on ,PEG p reci p itati on ,u ltra 2cen trifugati on and sucro se discon tinuou s gradien t u ltra 2cen trifugati on .T he p u rified viru ses w ere analyzed w ith SD S 2PA GE .　R esu lts :T he viru ses w ere allocated in 40%sucro se gradien t .T he five sp ecific structral p ro tein bands w ere p resen t in 18I CBDV strain s from ch icken ,duck and sp arrow .T here w ere no differences of the rates of p ro tein m igrati on in SD S 2PA GE am ong the I CBDV ,bu t there ex sisted app reciab le diversity of the exp ressi on of viral structu ral p ro tein V P 2am ong the I CBDV .　Conclusions :T he diversity of the exp ressi on of viral structu ral p ro tein V P 2w ere p resen t am ong differen t I CBDV .

Key word :　Infecti ou s cloacal bu rsal disease viru s ;　V iral structu ral p ro tein V P 2;　D iversity

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收稿日期:　2000210203

　　　基金项目:　江苏省应用基础研究项目(BJ 99049)

　　　作者简介:　周宗安(19432),男,河南柘城人,研究员,医学本科,从事分子病毒学研究。

　　传染性腔上囊病(infecti ou s cloacal bu rsa disease,I CBD)是严重危害我国养鸡业发展的主要疫病之一。接种疫苗是防止I CBD的最有效方法。近年来的临床实验表明,现行的I CBD疫苗的免疫效果不尽人意。多数学者认为免疫效果不理想的主要原因是由于野外流行的I CBDV发生了抗原性变异1,2,4,10。Is m al等4应用交叉中和试验发现,低剂量的变异株疫苗能保护鸡抵抗高、低剂量的标准株及变异株的攻击,而高剂量的标准株疫苗仅能保护低剂量变异株的攻击,但不能保护高剂量变异株的攻击。I CBDV“变异株”与“标准株”拥有相同的保护性抗原,疫苗的免疫保护率主要依赖于疫苗的免疫原性和剂量。由此可见,选择保护性抗原的高表达毒株对研制高效I CBDV疫苗十分重要。有研究证明,在我国不同地区动物体内分离的I CBDV毒株抗原性与毒力存在着差异7～10。I CBDV的变异表现在两个方面:一是病毒核酸碱基的突变,引起编码氨基酸的改变,这是病毒变异的主要原因;另一方面是病毒基因表达量的变化1,7。I CBDV的主要保护性抗原存在于病毒结构蛋白V P2上,可诱生中和抗体,从而保护雏鸡抵抗I CBDV的攻击,V P2与I CBDV的免疫效力有密切关系1～4。本研究旨在通过对不同源I CBDV结构蛋白的比较,了解不同禽鸟类携带的I CBDV的同源性及其变异;通过对结构蛋白V P2表达差异性分析,建立筛选I CBDV V P2高表达毒株的方法,为进一步研制I CBDV高效疫苗打下基础。

1　材料与方法

1.1　动物　本实验室所用1月龄SPF鸡和9～10日龄SPF鸡胚,均购自南京药械厂SPF鸡场。

1.2　病毒　鸡(Ch2I CBDV)、鸭(D u2I CBDV)和麻雀(Sp2I CBDV)源I CBDV,鸡胚适应毒为本实验室从鸡、鸭、麻雀分离保存的I CBDV毒株;I CBDV囊毒:94HA、98H F、98D T、96FJ、97SD、99QD、99Z B、99ZJ、98HN、98SH、95W X、97L YG;鸡胚毒:98J1、99J2;细胞毒:96NM。上述病毒均系本课题组在不同时间、不同地域收集保存的鸡源I CBDV毒株。1.3　病毒的增殖

1.3.1　囊毒　从临床诊断为I CBD并经I CBDV单克隆抗体夹心EL ISA检测为阳性的腔上囊病理组织,经滴鼻、口服和尾部注射感染1月龄SPF鸡,72 h内采取腔上囊组织。1.3.2　鸡胚毒　系I CBDV鸡胚适应毒,经绒毛尿囊腔途径接种9～10日龄SPF鸡胚,接种病毒4天内收集胚体。

1.3.3　细胞毒　系I CBDV细胞适应毒,以含100 mm o l L N aC l的M E M培养SPF鸡胚成纤维细胞(CEF),生长液含5%小牛血清,维持液含0.5%小牛血清(小牛血清于65℃灭活30m in),待细胞长成单层后再接种病毒,37℃吸附90m in,72h后收毒。

1.4　病毒的提纯　将I CBDV感染的腔上囊组织、胚体匀浆液(以等渗盐水稀释5倍)和细胞培养物冻融3次以上,超声波冲击3m in;2900r m in (4℃)离心20m in,取上清液;加等体积的氯仿,强烈振荡、离心,取上清液;用氯仿再处理1次。再向经氯仿处理的上清液加入终浓度为10%PEG(MW 6000)、

2.2%N aC l,置于4℃过夜;17700r m in (4℃)离心30m in,弃上清,加入适量pH8.0TN E 缓冲液,多次吹打,置于4℃下过夜;2900r m in (4℃)离心10m in,弃沉定。

　　对以上获得的病毒悬液,用90000r m in(4℃)超速离心3h,弃上清,以适量TN E缓冲液悬浮,然后在20%～60%不连续蔗糖密度梯度上,90000r m in(4℃)超速离心3h,分层收集。各层分别取2Λl 用I CBDV单克隆抗体夹心EL ISA检测。将病毒层用TN E稀释3倍以上,100000r m in(4℃)超速离心2h,弃上清,沉淀物用少量TN E缓冲液悬浮,即得纯化病毒。

1.5　SD S2PA GE分析　采用SD S2聚丙烯酰凝胶电泳(SD S2PA GE)对病毒样品进行分析,同时设SPF鸡腔上囊组织(组织匀浆经氯仿抽提处理)对照。浓缩胶5%,分离胶12%。

1.6　V P2表达量测定　用薄层扫描仪对各I CBDV 的SD S2PA GE凝胶图谱进行扫描,计算各毒株结构蛋白V P2的相对百分含量。

2　结　　果

2.1　病毒纯化　病毒悬液在20%～60%不连续蔗糖密度梯度上离心后,未出现明显的病毒带。用I CBDV单克隆抗体夹心EL ISA检测,吸光度(A)值分别为0%蔗糖层0.00,20%蔗糖层0.40,40%蔗糖层1.17,60%蔗糖层0.72,病毒分布在40%和60%蔗糖层,40%层含量最高。

2.2　SD S2PA GE分析　在I CBDV SD S2PA GE凝胶图谱中,鸡源、鸭源和麻雀源I CBDV毒株均出现5条特异蛋白带,依次为V P1、V P2、V P3、V P4和V P5 (图1、图2),各蛋白带的电泳迁移率,毒株间无明显

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・医学研究生学报2001年8月　第14卷　

图1　不同源I CBDV分离株结构蛋白SD S2PA GE分析结果F igu re1　A nalysis of structu ral p ro tein s(specific

po lypep tides)of differen t I CBDV by SD S2

PA GE

1.蛋白质分子质量标准;

2.PEG沉淀和超速离心处理的鸡胚

组织;　3.Sp2I CBDV;　4.D u2I CBDV;　5.Ch2I CBDV 差异;不同毒株结构蛋白图谱相似,但各结构蛋白的表达量有差异。

2.3　V P2表达量测定　对I CBDV SD S2PA GE凝胶进行扫描,各毒株的结构蛋白V P2相对百分含量差异明显(表1、表2)。

　　表1　不同源I CBDV分离株结构蛋白相对含量(%)

　　T ab le1　Comparisi on of relative percen tage

concen trati on of differen t I CBDV

structu ral p ro tein s(%)

蛋　白

毒　株

Ch2I CBDV D u2I CBDV Sp2I CBDV

V P114.18215.10917.772

V P216.51617.26714.291

V P334.65033.51141.591

V P413.29113.53712.802

V P521.36120.57613.

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图2　15株鸡源I CBDV毒株SD S2PA GE分析结果

F igu re2　A nalysis of15Ch2I CBDV by SD S2PA GE

泳道A:低分子量标准蛋白(相对分子质量为97400、66200、43000、31000、20100、14400),　B:94HA,　C:98H F,　D:

98D T,　E:96FJ,　F:97SD,　G:99QD,　H:99Z B,　I:99ZJ,　J:98HN,　K:98SH,　L:95W X,　M:97L YG,　N:

98J1,　O:99J2,　P:96NM,　Q:SPF鸡腔上囊组织对照

表2　不同I CBDV毒株结构蛋白V P2相对百分含量扫描结果

T ab le2　R elative percen tage concen trati on of structu ral p ro tein V P2of differen t I CBDV by scann ing 毒　株94H S98H F98D T96FJ97SD99QD99Z B99ZJ98HN98SH95W X97L YG98J199J296NM

V P2含量(%)20.19119.27317.48628.29027.91028.90237.17134.5108.41531.16115.38114.018.21316.51638.719

3　讨　　论

　　由于I CBDV的理化性质和病毒组织样品的成

分比较复杂,I CBDV的纯化比较困难5,9。本实验将

I CBDV组织样品经氯仿处理后,采用聚乙二醇沉

淀、超速离心和不连续蔗糖密度梯度离心的方法纯

化病毒。通过对不同的蔗糖层分部收集与病毒检测

表明,该方法可使大部分病毒得到回收,病毒主要分

布于40%蔗糖层,纯化的病毒可满足病毒结构蛋白

的分析。需要注意的是,因离心力、离心时间和基质

的变化,病毒在基质梯度中的分布会有所不同(在本

实验条件下,不连续蔗糖密度梯度离心时,若以

110000r m in(4℃)离心2.5h,病毒主要分布在

30%～40%蔗糖层)。因此,条件改变后应对不同的

梯度层分部收集与病毒检测,以确定病毒在梯度中

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　第4期　　周宗安,等　不同传染性腔上囊病病毒株结构蛋白表达差异性研究的分布。

　　I CBDV属双RNA病毒科成员,基因组由A、B 两个片段RNA组成,双节段dsRNA的特征性图谱在目前所发现的禽病毒中仅见于I CBDV,具有鉴定意义。已知病毒含有五种多肽,即V P1、V P2、V P3、V P4和V P5。病毒结构蛋白SD S2PA GE分析结果表明,本实验室分离的三种不同禽、鸟源I CBDV均有5条病毒特异蛋白带,病毒各条结构蛋白带的电泳迁移率毒株间无明显差异,但各病毒结构蛋白带的相对百分含量有变化,这从一个侧面反映了这些不同源的I CBDV分离株的同源性和变异。

　　鉴于I CBDV结构蛋白V P2是病毒主要保护性抗原,与病毒的免疫效力有密切关系。本研究对15个来自不同时间、地域的鸡源I CBDV分别进行了增殖、纯化和SD S2PA GE分析,结果显示,病毒结构蛋白V P2在不同毒株表达量有较大差异。本实验为大批分析I CBDV、从中筛选V P2高表达毒株提供了方法,为进一步研制I CBD高效疫苗奠定了基础。

　　(感谢施正良、兰邹然、张进林、范伟兴、朱瑞良、李新华、焦新安、侯继波、钱建飞、姜平、张存、金山为本实验提供帮助)。

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8　王永山,周宗安,高　健,等.传染性法氏囊病病毒V P2基因高变区序列分析[J.中国预防兽医学报,2000,22(2):1362 139.

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10　罗函禄,范文明,张菊英,等.传染性法氏囊病病毒 型变异株的分离鉴定及其多价弱毒疫苗免疫试验[J.中国兽医科技,

1996,26(7):325.

(本文责任编辑　陈根达)

(上接第284页)

一种鉴定新生隐球菌的方法,有较好的特异性和稳定性;同时联合应用两种培养基可以降低假阴性率。这就为临床快速鉴定新生隐球菌提供了一种简便、经济的方法,而且还可以为观察新生隐球菌病临床预后和检测菌种保存好坏提供一项有价值的参考指标。

参考文献:

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4　桑　红.新生隐球菌产黑素的研究进展[J.国外医学(皮肤性病分册),2000,26(6):27229.

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724.

(本文责任编辑　陈根达)

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