工业微生物
Industrial Microbiology
Vol.32No.1
Mar.2002
第一作者简介:苏令鸣(1952～),男,工程师
L -精氨酸产生菌的选育及其发酵条件的研究
苏令鸣, 王宜敏, 刘铁敏, 李象洪
(上海市工业微生物研究所,上海200233)
摘 要 以黄色短杆菌(B revibacteri um f lav um )A T174(AHV r ,TA r )为诱变出发株,经亚硝基胍(N TG )诱变处理,获得一株能够积累大量L -精氨酸的菌株A G 77(AHV r ,TA r ,SG r )。在20L 发酵
罐中,以葡萄糖为碳源,以硫酸铵等为氮源的培养基中培养4d ,产酸率可达31.3g/L 。关键词:氨基酸; 发酵; L -精氨酸; 黄色短杆菌; 诱变育种 L -精氨酸是合成蛋白质肌酸的重要原料,是人体和动物体中的半必需氨基酸,是幼小动物的必需氨基酸,在医药工业上具有广泛用途。L -精氨酸及其盐类广泛用于氨中毒性肝昏迷的解毒剂和肝功能促进剂。精氨酸也可使尿素循环活化而重新畅通,降低血氨,使肝昏迷症状缓解;精氨酸对肠道溃疡、血栓形成、神经衰弱和男性无精病等都有治疗效果
[1]
。因此早在二十世纪七十年代国外就开始研
究发酵法生产L -精氨酸[2,3]
。在八十年代,中国
科学院微生物研究所诱变选育出一株能够积累大量L -精氨酸的钝齿棒杆菌971.1,该菌株在2000L 发
酵罐中平均产酸率可达29.0g/L [4]。无锡轻工大学对发酵法生产L -精氨酸也进行了研究,王霞等以谷氨酸棒杆菌为诱变出发株,诱变选育出一株精氨酸高产菌JDN28-50,在摇瓶中产酸率可达30g/L [5]。本文报道了以黄色短杆菌(B revibacterium
f lavum )AT174(AHV r
,T A r )为诱变出发株,经亚硝基
胍(NTG )诱变处理,获得一株能够积累大量L -精氨酸的变异株AG 77(AHV r ,T A r ,SG r ),在20L 发酵罐中,平均产酸率可达31.3g/L 。
1 材料和方法
1.1 菌株
黄色短杆菌(B revibacteri um f lav um )A T174(AHV r ,TA r )。1.2 培养基
1.2.1 完全培养基(%):
蛋白胨,1.0;牛肉膏,1.0;酵母膏,0.5;NaCl ,0.5;葡萄糖,0.5;p H7.0～7.2(如果配固体培养基,
再加入琼脂2%),120℃灭菌20min 。1.2.2 基本培养基(%):
葡萄糖,1.0;(N H 4)2SO 4,0.3;KH 2PO 4,0.1;K 2HPO 4・3H 2O ,0.2;MgSO 4・7H 2O ,0.05;FeSO 4・
7H 2O ,0.002;MnSO 4・H 2O ,0.002;生物素,50μg/L ;硫胺素盐酸盐,200
μg/L ;p H6.8～7.0(如果配固体培养基,再加入琼脂2%),110℃灭菌25min 。1.2.3 种子培养基(%):
葡萄糖,3.0;尿素,0.25;玉米浆,2.5;KH 2PO 4,0.15;K 2HPO 4・3H 2O ,0.05;MgSO 4・7H 2O ,0.04;生
物素,50μg/L ;p H7.0～7.2,115℃灭菌15min 。1.2.4 发酵培养基(%):
葡萄糖,13;(N H 4)2SO 4,5.0;玉米浆,1.5;KH 2PO 4,0.10;MgSO 4・7H 2O ,0.04;尿素,0.1;生物
素,50
μg/L ;碳酸钙,5.0(分消);酚红,0.002;p H7.0～7.2,115℃灭菌15min 。1.3 培养条件
1.3.1 摇瓶发酵培养条件
接种后的摇瓶置往复式摇床,转速115r/min ,30℃培养72h 。
1.3.2 20L 发酵罐发酵培养条件
温度:30℃;p H :用氨水自动流加控制p H 6.5～7.0;通气量:0.6～1.0L /L (发酵液)/min ;转速:300～900r/min ;溶解氧:用调节转速控制溶解氧
1.4主要试剂
亚硝基胍(N TG):Fluka公司产品;磺胺胍(SG):Sigma公司产品。
1.5诱变方法及SG r变异株的检出方法
从新鲜斜面上挑取一环A T174菌株的菌体,接入装有40mL完全培养液的500mL摇瓶中,于30℃振荡培养16h,离心收集菌体,用无菌生理盐水洗涤菌体三次,用p H6.0的Tris缓冲液调至菌浓1×109个菌/mL的菌悬液,加入N TG至终浓度为0. 35mg/mL,30℃振荡处理45min后离心,用无菌生理盐水洗涤菌体三次,接入完全培养液中,30℃培养20h后离心,用无菌生理盐水洗涤菌体三次,制成不同稀释倍数的菌悬液,涂布在含0.5～2mg/mL SG 的基本培养基平板上,30℃培养3～5d,挑取长出的菌落,即为SG r变异株。
1.6 分析方法
1.6.1菌体生长测定: 吸1mL发酵液加9mL水(发酵液中含有碳酸钙时加9mL1mol/L盐酸),充分摇匀后,用581型光电比色计(65号滤色片)测定发酵液中的菌体光密度(O.D),用蒸馏水作为空白对照。
1.6.2 pH值测定: 用国产精密p H试纸(p H5.4～7.0和6.4～8.0试纸)进行测定。
1.6.3 还原糖测定: 采用改良的斐林氏试剂法。
1.6.4 L-精氨酸定性测定: 采用纸层析法,展层剂用77%乙醇∶二乙胺=100∶1,层析后用茚三酮-丙酮试剂显色[6]。
1.6.5 L-精氨酸含量测定: 采用坂口改良法[7]。
2 结果与讨论
2.1 L-精氨酸产生菌AG77的选育
以黄色短杆菌A T174(AHV r,TA r)为诱变出发株,经亚硝基胍(N TG)诱变及SG平板培养,共获得155株SG r变异株,经摇瓶筛选,选出黄色短杆菌变异株A G77作为进一步研究的试验菌。A G77菌株的选育谱系见图-1
。
图1 A G77菌株的选育谱系图
2.2 A T174菌株和AG77菌株对SG抗性的对比试验
分别将A T174菌株和A G77菌株培养在含不
同浓度SG的基本培养液中,30℃振荡培养30h后,
直接测定O.D值,结果见图2
。
图2 A T174菌株和A G77菌株对
SG抗性的比较
2.3摇瓶发酵试验
2.3.1 不同的间隔时间流加氨水对产L-精氨酸
的影响
培养液中单单用碳酸钙,其p H只能维持在6.0
左右,而菌体产生L-精氨酸的最适p H是6.5～
7.0,因此需要流加氨水使培养液的p H
经常维持在
图3 不同的间隔时间流加氨水
对产L-精氨酸的影响
—
2
—
第1期 工 业 微 生 物第32卷
6.5以上。图3表示了在菌体生长到一定的阶段
后,以不同的间隔时间流加氨水对产L -精氨酸的影响。从图3可以看出不流加氨水单纯用碳酸钙调节p H ,其菌体的生长和产酸都很差;如果流加氨水,使培养液的p H 经常维持在6.5以上,这样就有利于菌体的生长和产酸;最佳的间隔时间是每隔2h 流加一次氨水。
2.3.2 不同的玉米浆浓度对产L -
精氨酸的影响
从图4可知,随着玉米浆浓度的增加,菌体生长也增加,但L -精氨酸产量随着玉米浆浓度增加到1.5～2.0%,产酸达到最高,玉米浆浓度高于2.0%
时,产酸略有减少。
图4 不同的玉米浆浓度对产L -精氨酸的影响2.3.3 不同的硫酸铵浓度对产L -精氨酸的影响
图5 不同的硫酸铵浓度对产L -精氨酸的影响
从图5可知,硫酸铵在1%～6%的浓度中,对菌体的生长影响不大,而对产L -精氨酸影响较大。由于精氨酸是二十种氨基酸中含氮量最高的一种氨基酸,如果作为提供氮源的硫酸铵浓度过低,由于氮源不足,L -精氨酸产量也会降低。
2.4 20L 发酵罐发酵试验
在20L 自控发酵罐上对A G 77菌株产L -精氨酸的发酵过程进行了初步观察,其结果见表-1和图6。
表1 三罐批20L 发酵罐发酵试验结果
罐批号初糖(%)流加糖(%)
L -精氨酸(g/L )
转化率(%)
112.88.530.514.3213.28.531.314.43
13.3
8.5
32.214.8平均值
31.3
14.5
图6 第二罐批20升发酵罐发酵全过程
3 结论
(1)以黄色短杆菌A T174(AHV r ,TA r )为诱变
出发株,经亚硝基胍(N TG )诱变及SG 平板培养,选育出SG r 变异株A G 77,与A T174菌株相比较,其产酸率提高了18%。
(2)在摇瓶发酵过程中不流加氨水单纯用碳酸钙调节p H ,其菌体的生长和产酸都很差;如果流加氨水,使培养液的p H 经常维持在6.5以上,这样就有利于菌体的生长和产酸。
参
考
文
献
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[5] 王 霞,许正宏等.L-精氨酸产生菌的选育及其发酵条件.
药物生物技术,2001,8(4):210-212[6] 龚建华,丁久元等.L-精氨酸发酵条件的研究.微生物学报,
1988,28(3):257～2
[7] Rosenberg,H.et al.:Biochem.J.,1956,63:153
Studies on the breeding of L2arginine2producing mutant
and its fermentation conditions
SU Ling2ming,WAN G Y i2min,L IU Tie2min,L I X iang2hong
(Shanghai Institute of Industrial Microbiology,Shanghai200233)
Abstract A L2arginine2producing mutant A G77(AHV r,TA r,SG r)was derived from B revibacterium f lavum A T174 (AHV r,TA r)by treatment with N2methyl2N′2nitro2N2nitrosoguanidine(N TG).When it was cultured at30℃for4 days,it could accumulate31.3g/L L-arginine in the medium containing glucose as carbon source and ammonium sulfate as nitrogen source.
K ey w ords amino acid;fermentation;L2arginine;B revibacterium f lavum;breeding
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