摘要：从线粒体DNA复制的模型与机制、复制的、复制忠实性及其损伤修复3个方面对近年来的研究文献进行了总结.在复制的模型与机制方面,实验结果显示,在哺乳动物中还存在着链结合单向复制和链结合双向复制2种模型.在线粒体DNA复制的方面,近年来研究较多的因子主要包括mtDNA 聚合酶C、线粒体单链结合蛋白(mtSSB)、引物酶、解旋酶、连接酶、拓扑异构酶、转录因子mtTFA 等最新研究进展及机制; mtDNA 复制时期和拷贝数量机制的研究也有突破,确定了Abf2p 是mtDNA 复制时期与拷贝数目的因子.在mtDNA 复制的忠实性及其损伤修复研究方面,主要涉及DNA PolC的校正功能、错配修复、重组修复、DNA切除修复等,在mtDNA 损伤修复中仅存在碱基切除复机制, 缺少核苷酸切除修复机制.
关键词：线粒体DNA（mtDNA），复制，点突变，控制区，D-环复制，侧翼序列
前言：近期，中国科学院昆明动物研究所的研究人员在对我国人群mtDNA D-环区突变频谱的研究中，在一个正常人家系的mtDNA中意外发现其D-环存在一段50 bp的缺失（m.298_347del50），该缺失导致线粒体保守序列框Ⅱ（CSBⅡ）和线粒体复制起始过程中的引物结合区被移除，而这两个功能单元在以往的研究中被认为与mtDNA的复制起始有关。该50 bp缺失在研究的家系母系成员中可以遗传，且在不同的组织样本如头发、血液、唾液等都存在，具有不同程度的异质性。相对于正常对照人群血液细胞的mtDNA拷贝数来说，含有缺失的家系成员的mtDNA拷贝数未见异常，且该家系成员无相关遗传性疾病。这一发现对D-环区的这两个复制功能单元在复制模型中是否必需提出了疑问，提示mtDNA的复制机制可能比以前认为的更为复杂。研究推测，该家系成员的mtDNA的复制可能存在其他代偿途径。对此机制的深入研究，将有望进一步认识mtDNA复制的复杂机制。
正文：线粒体拥有自身的呈环状的双链DNA分子，其复制和转录受到线粒体和核基因的双重。线粒体DNA（mtDNA）复制主要存在两种模型，即链置换模型（the strand-displacement model）和链结合模型（the strand-coupled model）。链置换模型认为线粒体复制从特定位点起始，H链先单向复制到mtDNA分子的约2/3位置，使L链复制起始位点暴露，随即引发L链复制；而链结合模型认为线粒体复制从多个位点起始，双链同时双向进行复制。关于线粒体复制模型仍存在一些争论，但这两类复制模型都认为mtDNA中一段长约1kb的非编码序列，即控制区（control region）或称D-环（D-loop）与mtDNA复制密切相关，其中含有很多控制复制的功能元件如复制引物结合位点、复制起始位点、复制终止位点等。在现有mtDNA数据库中，尚未发现正常人D-环区有大片段插入和缺失的情况，这间接说明该区域在mtDNA复制中的重要作用。
目前,有关mtDNA 复制的研究多以酵母和哺乳类(或其它脊椎动物) 为研究对象.下面主要以哺乳动物为例来说明mtDNA 复制的结构特征及复制过程.哺乳动物的mtDNA 是一个长度约为 1615 kb 的结构紧密的双链闭合环状分子,外环为重链(H 链)内环为轻链(L链),其mtDNA 复制以D 环复制方式结构紧密的双链闭合环状分子,外环为重链(H 链),内环为轻链(L链),其mtDNA 复制以D 环复制方式进行 , 即 mtDNA 复制的链替换模型( strand-displacement model), 也是目前公认的大多数脊椎动物mtDNA 复制的经典模式 . 以人类mtDNA 的D 环复制为例(Fig. 1) ,位于mtDNA 非编码区内有2 个转录启动子, 分别为重链启动子(heavy-strand promoter,HSP)和轻链启动子( light-strand promoter,LSP), 重链复制的起始点(OH) 就位于此区域. 哺乳类的OH 包括1个启动子及其下游的3 个保守序列区(conserved sequenceblock,CSB Ñ, CSBÒ, CSBÓ) . 轻链复制的起始点(OL)则位于距离OH 约为整个环状mtDNA 的2P3位置.
哺乳动物mtDNA 的D 环复制过程大致可以分为以下4 个阶段:( 1)H 链的首先合成:在H 链复制起始点以L 链为模板, 首先合成一从轻链启动子(LSP)转录而来的RNA 引物,然后由DNA 聚合酶C催化合成一个500~ 600 bp 长的H 链片段, 该片段与L 链以氢键结合, 将亲代的H 链置换出来, 产生一种D环复制中间物.( 2)H链片段的延伸: 在各种酶复制相关酶和因子的作用下,复制叉沿着H 链合成的方向移动, 新生成的短的H 链片段继续合成.(3)L 链合成的开始: 随着原来的H 链被取代,D-环越来越大, 当D 环膨胀到环形mtDNA 约2P3 位置时, 即暴露出L 链复制的起始位点,单股 DNA 吸引mtDNA 引物酶合成第2 个引物,并以原来的H 链为模板开始L 链DNA 的复制.(4) 复制的完成:H 链合成首先完成,L 链的合成随后结束, RNA 引物的去除,完整的DNA 环的连接,最后以环状双螺旋方式释放.mtDNA 的D-环复制最大的特征是2 条链的合成是连续的, 后滞链的合成无需经历不连续的岗崎片段的合成与连接过程.酵母mtDNA 的复制方式与哺乳动物基本类似,主要区别在于哺乳类mtDNA 复制是单向起始的, 而酵母为双向起始复制 . 此外,Locker 等 在酿酒酵母线粒体NDA 复制中观察到长的线性DNA 链,推测其复制过程涉及到滚环复制模式; 此 外, 在 Torulopsis glabrata 和 Schizosa-charomycespomb mtDNA 复制中也发现了滚环复制 模式。mtDNA 复制模型的研究新进展 。
（1）、皮肤光老化与真皮成纤维细胞线粒体DNA复制控制区的点突变
目的：探讨皮肤光老化与真皮成纤维细胞线粒体 DNA复制控制区点突变的关系。
方法:以8-甲氧补骨脂素 /长波紫外线 (8- methoxypsoralen / ultraviolet A,8- MOP/ UVA)作用体外培养的真皮成纤维细胞 ,一步法提取线粒体 DNA,PCR方法扩增线粒体 DNA复制控制区 D环及毗邻转录启动子区域片段 6 (D- loop and adjacent transcription promoter 6 ,DL P6 ) ,并以聚合酶链反应 -单链构象多态性及直接测序的方法检测 PCR产物的点突变。
结果： 8- MOP/ UVA作用后 ,体外培养的真皮成纤维细胞线粒体 DNA复制控制区 DL P6 片段有大量 4 14 T→ G突变的累积。
结论:真皮成纤维细胞线粒体 DNA复制控制区DL P6 片段出现大量特异性点突变可能与皮肤光老化有密切关系
（2）、海洛因海绵状白质脑病患者线粒体DNA多态性的初步分析
目的:研究线粒体基因组DNA多态性与海洛因海绵状白质脑病发病的关系。
方法:测定6例海洛因海绵状白质脑病患者外周血以及脑组织中线粒体基因组的全序列。
结果:发现6例患者均存在3个具有共性的线粒体DNA多态性位点,其中A4659G和A5178C位于NADH2亚单位编码序列中,A10677G位于NADH4L亚单位编码序列中,对线粒体能量代谢产生影响。
结论:海洛因海绵状白质脑病可能存在一定遗传易感性,线粒体DNA多态性位点,特别是A5178C、A4659G以及A10677G可能在海洛因海绵状白质脑病的发生和发展过程中起到一定作用。
（3）、线粒体DNA变异与老年2型糖尿病患者易感性的相关性
目的：研究湖北地区老年2型糖尿病(T2DM)患者中线粒体基因突变的发生率及其相关性
方法：采用PCR-RFLP、基因测序技术,对175例老年T2DM患者和200例糖耐量正常的健康老年对照组进行检测。
结果：MIND1 3316(G→A)、MTTL1 3243(A→G)、MIND13394(T→C)、MIND14216(T→C)MIND141(A→G)和MIND2 5178(T→C)变异率分别为3.26%、2.72%、1.71%、4%、34.9%;对照组检出3316(G→A)突变2例(0.99%)、41 5例(0.99%)、5718(T→C)变异例(32.3%),未检出3394、4216的点突变;两组间3394(T→C)变异率差别有统计学意义(P<0.05);且T2DM组5178A基因型血清TC水平低于5178C基因型(P<0.05),但TG、LDL-C、HDL-C、apoA、apoB、Lp(a)水平两组无统计学意义。
结论：3394(T→C)与老年T2DM患者的易感性有一定关联,5178(T→C)变异与湖北地区老年汉族人T2DM的脂代谢相关。
（4）、骨肉瘤线粒体DNA含量变化及其临床意义
目的：分析骨肉瘤线粒体DNA(MtDNA)含量的变化,探讨线粒体DNA在骨肉瘤发生、发展中的作用。
方法：应用荧光定量PCR(quantitative real time PCR,QPCR)技术检测20例骨肉瘤组织以及5例正常骨组织MtDNA含量,并结合骨肉瘤主要临床病理参数进行分析。
结果：骨肉瘤组织中MtDNA含量较正常骨组织降低了71%,差异有统计学意义(P<0.05),且MtDNA含量与骨肉瘤的转移密切相关(P<0.05),而与年龄、性别、肿瘤部位以及肿瘤病理学类型均无相关性。
结论：MtDNA含量降低与骨肉瘤的发生、发展有着密切关系,并有可能成为一种新的骨肉瘤转移性标记物。
（5）、克隆棉花线粒体atpA双拷贝基因及其侧翼序列
目的：将优化的反向PCR(Inverse PCR,iPCR)与TAIL-PCR相结合,有效地克隆双拷贝基因及其侧翼序列。
方法：先用Southern blotting方法确定一种能获得合适长度片段的性内切酶,然后用优化的iPCR方法对该酶切产物进行自连和扩增,将2个拷贝的侧翼序列区分开。并根据iPCR结果,进一步用TAIL-PCR扩增更远侧翼的序列。
结果：可获得了棉花可育胞质和不育胞质线粒体双拷贝atpA基因的所有EcoR I片段(2.2～5.1 kb)和HindⅢ片段(8.5～11.7 kb),克隆到2个拷贝各自的侧翼序列。
结论：优化的iPCR与TAIL-PCR相结合是克隆双拷贝基因及其侧翼序列的一种高效方法。
（六）、营养剥夺诱导髓核细胞的表达及线粒体转位实验
目的：通过营养剥夺模拟体内髓核细胞退变微环境,检测Bcl-2/腺病毒干扰蛋白3(Bcl-2/adenovirusE1B 19-kDa-interacting protein 3,BNIP3)表达及线粒体转位情况,为进一步探索髓核细胞退变死亡机制提供实验依据。
方法：成年清洁级SD大鼠2只,雌雄不限,体重150～200 g。体外分离获取鼠尾椎问盘髓核细胞,将传代后细胞分别置入正常环境(对照组:L-DMEM培养基、10%FBS、21%O_2)和营养剥夺环境(实验组:DMEM无糖无血清培养基、1%O_2)培养24、48、72 h后,实时荧光定量PCR、细胞免疫荧光染色及Western blot检测BNIP3基因及蛋白表达,流式细胞仪检测凋亡率及线粒体膜电位。
结果：实时荧光定量PCR、细胞免疫荧光染色及Western blot检测显示对照组细胞低表达BNIP3;实验组随培养时间延长,BNIP3表达呈上升趋势,且BNIP3与线粒体相结合;除培养后24 h实验组BNIP3基因表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)外,其余各时间点实验组BNIP3基因及蛋白表达与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪检测显示,对照组细胞凋亡率较低,且细胞保持较高的线粒体膜电位;而实验组随培养时间延长细胞凋亡率增加、线粒体膜电位降低,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。
结论：营养剥夺可能通过诱导BNIP3表达增加并结合线粒体导致线粒体功能障碍,最终导致髓核细胞死亡。
（七）、低硒、氧化应激和线粒体DNA D-Loop区突变间的关系
目的：初步探讨低硒、氧化应激和线粒体DNA D-Loop区突变三者之间的相关性。
方法：采用人工饲养的方法建立低硒小鼠模型,分为低硒30天、90天和正常组;原子吸收法检测肝脏硒含量;HE染色检测低硒对小鼠各脏器(心脏、肝脏、肾脏、脑)的病理形态学影响;基因芯片检测氧化还原酶类基因的表达并通过检测机体GSH-Px(谷胱甘肽过氧化物酶)、SOD(超氧化物歧化酶)和MDA(丙二醛)的含量进行机体抗氧化应激能力的检测;PCR-SSCP技术结合DNA测序筛选线粒体DNA D-Loop区的突变。
结果：成功建立低硒小鼠模型;低硒小鼠各脏器(心脏、肾脏、脑)均出现不同程度的病理形态学改变;低硒状态下机体处于高氧化应激状态,且随着低硒时间的延长机体的抗氧化状态减弱。在低硒组和对照组中均发现线粒体DNA D-Loop区存在一个多态性位点16 154位(A/T)rs33254715。
结论：低硒与单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点:16 154(A/T)的发生并无直接联系,它既不随着低硒时间的延长而积累,也不存在组织特异性。
近年来,Yang等 和Holt 等 提出一种新的哺乳动物mtDNA 复制的模型, 即链结合模型( strand- coupled model). 与经典的链替换模型相比较, 这种改进的模型主要有以下特征: 2 条链同时进行复制,且复制可以起始于多个位点,可能还涉及到不连续的岗崎片段的合成;mtDNA 合成过程需要有大量的核糖核苷酸的参与; 实验检测到的复制中间体大多数都为双链,对D 环的存在提出了质疑.
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