使用说明

目录号：1125

适用于快速提取全血高纯度总RNA

试剂盒组成、储存、稳定性：

储存事项：

1.所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。

2.不合适的储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。裂解液RL可以常温运输，收到后4℃避光保存。

3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

产品介绍：

改进的异硫氰酸胍/酚一步法裂解细胞和灭活RNA 酶， 然后总RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤, 去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除， 最后低盐的RNase free water将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

产品特点：

1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。

2.结合了异硫氰酸胍/酚一步法试剂稳定性好，纯度高和离心柱方便快捷的优点，不需要异丙醇沉淀和乙醇洗涤过程，RNA可以直接从离心柱上洗脱避免了过度干燥不易溶解问题。

3.独有的RL裂解液配方，可以有效的消除基因组污染。

4.多次漂洗去蛋白过程，提取RNA纯度更高。

5.有效的去除了5S在总RNA中含量，提高了纯度。

注意事项：

1.第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

2.所有离心步骤如未加说明，均在室温进行。使用转速可以达到13，000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

3.裂解液RL和去蛋白液RE中含有刺激性有害化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

4.考虑到环保问题，本试剂盒不含有实验室常用试剂氯仿，用户使用前需要自备氯仿。

5.常规的琼脂糖凝胶电泳和变性胶电泳均可以用来分析RNA的质量。好的RNA产物在电泳后应该可以看到明显的二条优势核糖体RNA带，分别为~5Kb（28S），~2Kb（18S），条带亮度比值约为2：1。有时候也可以看到~0.1kb和0.3Kb(5S，tRNA)带。但有时候根据不同的物种如某些植物组织可以看到4，5条带也属于正常现象，如果RNA未成熟的前体或者不均一核RNA、小核RNA提取出来也可能看到介于7Kb和15Kb之间的不连续的高分子量条带。

6.检测OD260/OD280吸光度比值时，RNA样品应该溶于TE后检测，如果用水稀释后检测，由于一般水离子强度和PH值低，会使OD280升高，从而使比值降低。

7.加入裂解液RL匀浆后，加氯仿前，样品可在 –60℃-70℃ 保存一个月以上。

8.关于DNA 的微量残留：

一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留, 在大多数RT-PCR 扩增过程中极其微量的DNA残留（一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见）影响不是很大, 如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR,我们建议在进行模板和引物的选择时：

1)选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。

2)选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。

3)将RNA提取物用RNase-free的DNase I 处理。

4)在步骤去蛋白液RE漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I消化处理。

操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）

⇨提示：第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量乙醇! 

⇨使用前将10X红细胞裂解液RLB用DEPC处理水稀释到1X。

1.在适合大小的RNase free离心管中加入1体积（ 0.5-1.0ml）加入各种抗凝剂新鲜血液 (颠倒混匀后)和3体积的红细胞裂解液RLB,颠倒混匀,可轻弹管壁,确保混匀。

病人血样中白细胞数量可能大幅增加或者减少, 应该适当增加或者减少处理量。

2.室温放置10分钟（期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞）。

如果RNA降解严重,可在冰上裂解,但是时间可长一些以充解。

3.12,000 rpm离心20秒，倒弃红色上清，并小心的尽可能多的吸弃上清（注意不要吸到管底的细胞团），留下完整的管底白细胞团。 

离心后在管底应该见到白色的白细胞团，也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起，但是如果看到的是大部分的红色细胞团，说明红细胞裂解很不充分，应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤2，3。

上清尽可能的吸弃,残留过多会稀释裂解液,造成裂解结合异常,产量纯度降低。

4.涡旋或者轻弹管壁将白细胞沉淀完全松散重悬，加入1ml的RL,  用移液反复吹打来裂解细胞。

5.将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15 -30°C条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。

6.每1ml RL加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并室温下放置2分钟。

7.于4℃12，000rpm 离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加RL体积的60%，把水相转移到新管中，进行下一步操作。

8.加入1倍体积70％乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!），颠倒混匀（此时可能会出现沉淀）。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中（吸附柱套在收集管内）。

9.12，000rpm 离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。

10.加500μl 去蛋白液RE，12，000rpm 离心45秒，弃掉废液。

11.加入500μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心45秒，弃掉废液。

12.加入500μl漂洗液RW，12,000 rpm 离心45秒，弃掉废液。

13.将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

14.取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加50-80μl RNase free water（事先在 65-70℃水浴中加热效果更好）， 室温放置2分钟，  12,000 rpm 离心1分钟。如果需要较多RNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟,或者另外再加30μl RNase free water，离心1分钟，合并两次洗脱液。

洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要RNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积最好不少于30μl，体积过小降低RNA洗脱效率，减少RNA产量。

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