文章编号:1673216(2005)022******* 收稿日期:2004204220; 修回日期:2004209203.
作者简介:毕金峰(19702),男,吉林辉南人,副教授,农学博士,博士后.
黑曲霉产α2转移葡萄糖苷酶固态发酵条件优化
毕金峰1, 魏宝东2, 李长彪2
(1.中国农业科学院农产品加工研究所,北京100094;2.沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳110161)
摘 要:对产α2转移葡萄糖苷酶的黑曲霉U 菌株固态发酵条件进行了优化.结果表明:麸皮和水
的质量比为1∶1较好,35℃培养48h 时产酶量及酶活较高;U 菌株生长的最适p H 值为610;麸皮中的碳源和氮源可以满足该菌株产酶的需要,可以不外加碳源和氮源.关键词:α2转移葡萄糖苷酶;黑曲霉;固态发酵中图分类号:TQ 920.1
文献标识码:A
Studies on Solid 2State Fermentation Conditions for Producing
α2T ransglucosidase from As p.ni ger
B I Jin 2feng 1, WEI Bao 2dong 2, L I Chang 2biao 2
(1.Institute of Food Science and Technology ,Chinese Academy of Agricultural Sciences ,Beijing 100094,China ;2.College of Food Science ,Shenyang Agricultural University ,Shenyang 110161,China )
Abstract :Alp ha 2t ransglucosidase is a critical enzyme for producing isomaltooligosaccharide.The solid 2state fermentation conditions for p roducing α2t ransglucosidase f rom A s p.ni ger U were st udied.The optimum conditio ns for fermentation in solid 2state were :bran :water (m/m )=1∶1,cult ure temperat ure and duration were 35℃and 48h respectively ,t he optimum p H value was 6.0.Additio n of carbon and nit rogen sources into t he cult ure medium of bran was not required ,as t he carbon and nit rogen sources in bran could satisfy t he needs for t he enzyme p roduction.K ey w ords :α2t ransgluco sidase ;A s p.ni ger ;solid 2state fermentation
α2转移葡萄糖苷酶(α2t ransgluco sidase E.C.
2.4.1.24)又称α2葡萄糖苷酶(α2gluco sidase E.C.
3.2.1.20),它可以从低聚糖类底物的非还原性末端切开α21,4糖苷键,释放出葡萄糖,或将游离出的葡萄糖残基以α21,6糖苷键转移到另一个糖类底物上,从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖(以下简称IMO ,主要包括异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖等)、糖脂或糖肽等.该酶既具有水解能力,又具有转移能力,故对其命名说法不一[1～3].α2转移葡萄糖苷酶在自然界中分布广泛,种类繁多,性质各异,几乎存在
于所有生物体内,在人类的糖原降解及动物、植物
和微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能.它作为工业化生产IMO 的关键酶制剂倍受国内外食品工业界的重视[4,5].与国外相比,我国的研究工作还处于起步阶段,主要集中在α2转移葡萄糖苷酶生产菌株的筛选方面,对于其性质、化学结构、催化机制等方面的报道较少.目前,国外生产的α2转移葡萄糖苷酶大部分为纯酶,国内研究主要以粗酶液为主.作者在选育出高产α2转移葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株基础上,对黑曲霉固态发酵条件进行了优化研
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌种 作者所在实验室经诱变选育的高产α2转移葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株U.
1.1.2 培养基
1)斜面培养基(PDA):马铃薯去皮、切碎,称取200g,切成条或块,加水1000mL,煮沸30min,双层纱布过滤,取滤液,用水补足至1000mL,加葡萄糖50g,琼脂20g,p H值自然.
2)固体麸皮培养基:麸皮(沈阳市东大面粉厂生产),水,营养物.
1.2 主要仪器
HZQ2F160全温振荡培养箱:哈尔滨市东联电子技术开发有限公司制造;10122A数显电热鼓风干燥箱:上海沪南科学仪器联营厂制造;SW2CJ21F 超净工作台:苏州安泰空气技术有限公司制造; DW400/50L立式电热蒸汽两用消毒器:上海光华机械厂制造;全自动显微照相设备:日本奥林巴斯光学工业株式社制造;高速冷冻离心机:日本himac CR21G;高效液相色谱仪:美国Waters600E.
1.3 试验方法
1.3.1 相对酶活测定方法 国际酶学委员会规定:在一定条件下(p H值、温度、离子强度等),1 min内将1μg分子的底物转化为产物的酶量定为一个国际单位(I.U.).用直接滴定法测定α2转移葡萄糖苷酶作用于一定浓度的底物(麦芽糖)生成产物还原糖的量,用消耗反应液体积来间接反映α2转移葡萄糖苷酶的酶活,即相对酶活.通过试验证明用直接滴定法测还原糖所消耗的酶反应液体积(以下简称耗糖体积)来反映酶活与定量测定结果趋势一致.说明耗糖体积越多,反应液中还原糖含量越低,则在单位时间内α2转移葡萄糖苷酶水解底物(麦芽糖)的能力越差,即相对酶活越低;反之相对酶活越高.
1.3.2 还原糖测定方法 直接滴定法[10].
2 结果与分析
2.1 U菌株形态观察
U菌株菌丝较短,白色,成熟时孢子呈棕褐色,较小,在显微镜下观察结果见图
1.
图1 U菌株形态(右)(40×16)
Fig.1 Morphology of strain U(right)(40×60)
2.2 麸皮加水量对产酶的影响
在10g干麸皮中分别加入5,10,15,20,25mL 蒸馏水,用玻璃棒搅匀,密封后于60℃水浴锅中保温1h,并于121℃灭菌60min,冷却.接种U菌株孢子悬浮液0.5mL于5个不同处理中,用玻璃棒搅匀后置于35℃下培养48h.准确称取培养好的麸曲3g,加入30mL蒸馏水,室温浸泡6h,4℃于5000r/min离心20min,取上清液作为粗酶液.取5mL具塞刻度试管若干,分别加入1mL20g/dL 麦芽糖、1mL p H5.4的缓冲液,在55℃水浴锅中保温5min后,加入上述不同处理的酶液1mL,反应1h后灭酶(沸水浴中5min),测定不同处理的相对酶活,结果见图2.可知该菌在加入10,15mL水时,固态培养菌所产酶的酶活较高,观察发现菌丝生长状态良好,确定最佳麸皮和水的质量比为1∶1.
图2 加水量对相对酶活的影响
Fig.2 E ffect of w ater qu antity on relative enzyme ac2 tivity
2.3 麸皮pH值对产酶的影响
配制不同p H值的磷酸氢二钠2柠檬酸缓冲液,称取麸皮10g,加入不同p H值的缓冲液10mL,其他操作同2.2,测定不同处理的相对酶活,结果见图3.可知U菌在p H值6.0时产酶酶活较高.定期观察菌株生长状况时发现,在此p H值条件下生长状况良好.
2.4 培养温度对菌株生长及产酶的影响
称取麸皮10g,按质量比为1∶1的比例加入水,其他操作同2.2.于不同温度下进行固态发酵试验,酶反应结果见图4.可知35℃是该菌的最佳产
66食 品 与 生 物 技 术 学 报 第24卷
酶温度.定期观察菌株生长状况时发现,30℃和35℃处理时菌体生长状况良好
.
图3 pH 值对相对酶活的影响
Fig.3 E ffect of pH value on relative enzyme activity
图4 温度对相对酶活的影响
Fig.4 E ffect of temperature on relative enzyme activity
2.5 接种量对产酶的影响
在10g 麸皮中分别加入9.75,9.5,9.0,8.0,
6.0mL 蒸馏水,水浴、灭菌,对应接种孢子菌悬液0.25,0.5,1.0,2.0,4.0mL ,35℃培养48h ,在同
一条件下制取酶液,进行酶反应,结果见图5.U 菌株接种量超过1mL 时,酶活差别不显著,确定1.0mL 为最佳接种量.
图5 接种量对相对酶活的影响
Fig.5 E ffect of inoculation volume on relative enzyme
activity
2.6 最佳培养时间试验
当麸皮和水的质量比为1∶1,接种量为1mL
时,定期观察菌株生长状况,并定期取样制取酶液,进行酶反应,结果见图6.培养48h 时,U 菌已长出孢子,菌丝体量达到最大值.酶活测定结果表明,培养48h 时,酶活已经较高,确定最佳培养时间为48h.2.7 浸提时间对产酶的影响
麸皮和水的质量比为1∶1,接种量为1mL ,35℃培养48h.按1g 菌体加入10mL 无菌水室温浸
泡,在不同时间离心取酶液,并测定酶活,结果见图7.可知室温浸提6h 时即获得较高酶活,浸提时间
延长到24h 时,酶活未见明显提高,浸提时间过长,
可能引起霉菌的二次生长,导致酶活降低.因此,选择室温浸提6h 即可
.
图6 培养时间对相对酶活的影响
Fig.6 E ffect of culture time on relative enzyme
activity
图7 浸提时间对相对酶活的影响
Fig.7 E ffect of extracting time on relative enzyme activity
2.8 外加碳源对产酶的影响
配制5g/dL 的不同碳源.称取10g 麸皮,分别加入上述配好的溶液10mL.每种碳源两瓶,一瓶接种U 菌株,一瓶对照(C K1).在相同条件下培养菌株,制取酶液,进行酶反应,结果见表1.同时做不外加碳源的接种(C K2)对照,其耗糖体积为7185mL.可知外加碳源但未接种的对照间差别不显著,
只有葡萄糖的还原能力略高些.不同外加碳源对产酶的影响较小,外加葡萄糖碳源的相对酶活略高些,但因葡萄糖本身还原能力也较强,因此最终结
果无太大差异.外加碳源与未外加碳源的处理差别不显著.从生产成本上考虑,以麸皮作培养基,可不外加其他碳源,但当大规模生产时可适量加入.
表1 外加碳源对相对酶活的影响
T ab.1 E ffect of carbon sources on relative enzyme activity
碳源耗糖体积/mL
C K1接种
蔗糖15.107.85麦芽糖15.107.80葡萄糖14.657.75淀粉15.507.90可溶性淀粉
15.75
7.80
7
6 第2期毕金峰等:黑曲霉产α2转移葡萄糖苷酶固态发酵条件优化
2.9 外加氮源对产酶的影响
配制3g/dL 的不同氮源,取不同氮源溶液10
mL ,加入到10g 麸皮中,灭菌接种,定期观察结果,并进行产酶分析,结果见图
8.
1.牛肉膏;
2.尿素;
3.L 2谷氨酸;
4.蛋白胨;
5.酵母膏;
6.氯化铵;
7.铵;
8.硫酸铵;
9.磷酸氢二铵;CK.未加
氮源处理.
图8 外加氮源对U 菌株相对酶活的影响
Fig.8 E ffect of nitrogen sources on relative enzyme ac 2
tivity of strain U
由图8看出,U 菌株在1,4,5号外加氮源上生长较好,产酶酶活较高.因此选择牛肉膏、蛋白胨、
酵母膏3种氮源,用1,3,5g/dL 3个质量浓度进一步做氮源试验,结果见表2.C K 为加水试验,其耗糖体积为9110mL.可知不同质量浓度的外加氮源对菌株的影响不同.U 菌株在牛肉膏中生长良好,酶
活较高,几个质量浓度的处理均好于不外加氮源的对照.但牛肉膏价格昂贵,不利于降低生产成本.因
测试结果与对照差异不显著,固体麸皮培养基中可不外加氮源,大规模生产时可寻找廉价氮源.
表2 外加氮源对相对酶活的影响
T ab.2 E ffect of nitrogen sources on relative enzyme activity
氮源耗糖体积/mL U (1g/dL )U (3g/dL )U (5g/dL )
牛肉膏8.838.808.80酵母膏9.008.909.15蛋白胨
9.05
8.90
8.87
3 结 论
1)诱变选育出一株产α2转移葡萄糖苷酶酶活
较高的黑曲霉—U 菌株,其固体培养方式产酶酶活明显高于液体培养方式,所产酶属于细胞外酶.
2)固态发酵产酶条件优化结果表明,麸皮和水的质量比为1:1较好,35℃培养48h 时产酶量及酶活较高,U 菌株生长的最适p H 值为6.0,麸皮中的碳源和氮源可以满足该菌株产酶的需要,可以不外加碳源和氮源.
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(责任编辑:李春丽)
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