梁新红,孙俊良,唐玉,郭祖峰

（河南科技学院,河南新乡453003）

摘要：

纯化了黑曲霉Aspergillus niger FJL 0801糖化酶,并对其酶学性质进行研究.粗酶液经纯化后,较粗酶液纯化了38.42倍,酶活回收率达到17.45%.酶最适作用温度为60℃；最适反应pH 值为4.5；在60℃下,保温2h 后,相对酶活42%±2.8%.在pH4.5,60℃下,作用时间在60min 以内,其酶活保存%±2.56%；其酶学性质符合淀粉糖化工业化过程中对酶的要求,该酶比较适合应用于淀粉糖化工业.关键词：

糖化酶；黑曲霉；分离纯化；酶学性质中图分类号：TS201.3文献标志码：

A 文章编号：

1008-7516（2011）04-0024-04Purification and properties of a glucoamylase from Aspergillus niger

Liang Xinhong,Sun Junliang,Tang Yu,Guo Zufeng

（Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China ）

Abstract:A glucoamylase produced by Aspergillus niger FJL 0801was purified and the properties was

subsequently measured.The crude amylase was purified 38.42times with 17.45%recovery of enzyme activity.The enzyme proerties showed that the optimum pH and temperature was 4.5and 60℃,respectively.After a further reaction at pH 4.5for 2h,the relative enzyme activity is 42%±2.8%；and within 60minutes,the relative enzyme activity is %±2.56%.The glucoamylase is suitable for applying in starch sugar industry.

Key words:glucoamylase,Aspergillus niger ,purification,properties

糖化酶又称葡萄糖淀粉酶（Glucoamylase EC 3.2.1.3）,是一种外切型糖苷酶,从淀粉的非还原性末端依次水解α-1,4糖苷键,水解下一个个葡萄糖单元,工业上用于将淀粉转化为葡萄糖,因而广泛地用于

制药、制酒及氨基酸、有机酸行业,是最重要的工业酶制剂之一[1-2].黑曲霉（Aspergillus niger ）是生产葡萄糖淀粉酶重要菌株之一[3-4].发酵液中糖化酶的分离纯化及酶学性质研究对糖化酶在工业中应用至关重要[5].本研究拟对已筛选到的A.niger FJL 0801进行分离纯化,并研究其酶学性质,以丰富糖化酶研究内容,为可能的工业应用开发新的糖化酶资源.

1试验材料与方法

1.1试验材料

菌种：黑曲霉（Aspergillus niger FJL 0801）,河南科技学院食品学院微生物实验室冷藏保存.

DEAE-Fast Flow 阴离子交换柱

（16mm ×100mm ）,Superdex-75层析柱（26mm ×600mm ）,美国惠普公司.

1.2试验方法

1.2.1发酵产酶条件发酵摇瓶培养基：

淀粉10g ；NaNO 32g ；K 2HPO 41g ；KCl 0.5g ；M gSO 4·7H 2O 0.5g ；FeSO 4·7H 2O 0.01g ；蒸馏水1000mL,自然pH.

doi:10.3969/j.issn.1008-7516.2011.04.007

第39卷第4期394

Vol.No.河南科技学院学报

Journal of Henan Institute of Science and Technology

2011年8月2011

Aug.收稿日期：2011-05-18

基金项目：河南省教育厅自然科学研究资助计划项目（2010A550004）；河南科技学院博士基金资助项目（08001）作者简介：

梁新红（1971-）,女,河南新乡人,副教授,博士.研究方向为食品生物技术.

发酵摇瓶培养：把发酵摇瓶培养基装入250mL 三角瓶中,装液量为80mL.按5%接种量把半干体培养基接种于发酵摇瓶培养基中,于33℃下恒温摇床培养,转速为210r/min.

1.2.2糖化酶的分离纯化发酵液6000r/min 离心15min 去菌体,所得上清液为粗酶液,总量为200mL.粗酶液进行80%饱和的硫酸铵盐析沉淀,8000r/min 离心30min,沉淀经去离子水透析,进行冷冻干燥.冻干后,用3mL 柠檬酸-磷酸氢二钠（pH4.5）缓冲液溶解后,上DEAE-52阴离子交换柱（16mm ×100mm ）,采用10mmol 的Tris-HCl 缓冲液（含2mmol CaCl 2,pH8.4）进行平衡,上样后使用含有0~1mol NaCl 的同样缓冲液进行梯度洗脱,洗脱速度为2mL/min,收集合并酶活峰后,上预先经10mmol 的Tris-HCl （pH6.5）缓冲液平衡好的Superdex-50层析柱（26mm ×600mm ）进行洗脱,洗脱速度2mL/min,收集合并酶活峰,经去离子水透析,冻干,用于酶学性质研究.

1.2.3糖化酶活力测定方法粗酶液活力按照GB/T 1805.2-93测定[6].

1.2.4蛋白含量测定按Bradford 方法测定[7],以牛血清白蛋白绘制标准曲线.1.3酶学性质

1.3.1最适反应温度及热稳定性在不同温度下按照标准方法测定酶活,以酶活最高者为100%.热稳定性试验中测残余酶相对活力,以未保温的酶液的酶活为100%.

1.3.2酶的最适反应pH 值及pH 值稳定性将酶液分别用pH3.0~6.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,pH6.0~8.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释,按标准方法测酶活力.

1.4数据处理

试验平行重复4次.采用DPSv7.55数据处理软件对试验数据的方差显著性进行分析.

2结果与分析

2.1酶的分离纯化

黑曲霉糖化酶粗酶液经硫酸铵盐析、DEAE-52阴离子交换柱和Sephadex G-50凝胶层析后,酶蛋白得到明显纯化.糖化酶的纯化结果如表1.

表1糖化酶纯化结果

回收率（%）10083.3349.2117.45

纯化倍数1.0010.23.4438.42

比酶活（U/mg ）

1.5216.1735.6358.40

总蛋白含量（mg ）78174.206123.691367.58145.60

总酶活（U ）118825.3199020.3748727.058502.86

纯化步骤粗酶液盐析DEAE-52Superdex-50

由表1可知,纯化后酶的比活力达到了58.40U/mg,较粗酶液纯化了38.42倍.但在纯化过程中,酶活

回收率达到17.45%,酶蛋白的损失主要在DEAE-52阴离子交换柱及Sephadex G-50凝胶层析.2.2酶的最适反应温度

把经分离纯化的糖化酶在不同温度下测定酶的活力,以探索糖化酶最适作用温度,结果如图1.

由图1可知,A.niger FJL 0801糖化酶在30~60℃的温度范围内随着温度升高,相对酶活力（相对酶活规定方法：在一定温度下所测最高酶活,其相对酶活为100%）逐渐升高,在温度为60℃时,相对酶活达最高100%.反应温度高于60℃后,相对酶活急剧下降,温度为70℃时,相对酶活只有16.57%±0.94%,当温度达到90℃时,酶活为零.因此,糖化酶最适作

图1温度对A.niger FJL 0801糖化酶活性的影响

梁新红等：黑曲霉糖化酶分离纯化与酶学性质研究第4期

用温度为60℃.

2.3酶的温度稳定性

把经分离纯化的糖化酶分别在30~60℃下保温2h,然后测定其残留酶活,即为糖化酶在此温度下稳定性,结果如图

2.

图2 A.niger FJL 0801糖化酶的温度稳定性图3pH 值对A.niger FJL 0801糖化酶活性的影响

由图2可知,糖化酶经2h 保温后,在30~60℃温度范围内其酶活均有损失,温度越高,酶活损失越多.在30℃下,保温2h 后,相对酶活（在不同温度下未保温前测定酶活力的相对酶活力为100%.然后在同样温度下保温2h,再次进行酶活力的测定,测定残留酶活与未保温酶活之比为保温后的相对酶活）为92%±3.2%；在最适作用温度60℃下,保温2h 后,相对酶活只有42%±2.8%.因此,在糖化酶应用时,应同时考虑酶的最适作用温度及应用温度的稳定性,以达到最优糖化效果.

2.4酶最适作用pH 值

考察在pH 值范围为3.5~7.5的经分离纯化的A.niger FJL 0801糖化酶的最适反应pH 值.结果如图3.由图3可知,该酶的的最适反应pH 值为4.5,在pH4.5~5.5有较高的活力,其相对酶活（规定0h 测定酶活值的相对酶活为100%,其它时间相对酶活为测定酶活值与0h 酶活值之比）为100%±4.13%~76.23%±3.25%.在pH 为3.5和6.5时,酶活极低,相对酶活分别只有5.1%±0.26%和6.59%±0.36%,在pH 为7.0时,检测不到酶活,酶活为0.因此,糖化酶最适作用pH 值为4.5,酶应用中,溶液pH 值应高于4.0及低于6.0.

2.5酶的pH 值稳定性

在pH 值为4.5时60℃保存一定时间,考察最适作用pH 值稳定性.保存时间设定为0~2h,结果如图4.

由图4可知,糖化酶在最适作用pH 值下,60℃作用糊精溶液0~120min,其相对酶活从100%±3.19%降至42%±2.8%,表明在最适作用温度及pH 值下,其酶活力逐渐下降.作用时间在60min 以内,其酶活保存%±2.56%；继续增加作用时间,其酶活保存率较低,从%±2.56%降至42%±2.8%.因此,在糖化酶应用中,在酶的最适温度和pH 值下,应掌握好酶的作用时间.

3结论

黑曲霉糖化酶粗酶液经硫酸铵盐析、DEAE-52阴离子交换柱和Sephadex G-50凝胶层析后,酶的比活力达到了58.40U/mg,较粗酶液纯化了38.42倍,酶活回收率达到

17.45%.图4 A.niger FJL 0801糖化酶的pH 值稳定性

2011年河南科技学院学报（自然科学版）

经分离纯化的糖化酶其最适作用温度为60℃；糖化酶在30℃下,保温2h后,相对酶活为92±3.2%；在最适作用温度60℃下,保温2h后,相对酶活只有42%±2.8%.

酶的的最适反应pH值为4.5,在pH4.5下,60℃作用糊精溶液作用时间在60min以内,其酶活保存%±2.56%；继续增加作用时间,其酶活保存率较低,从%±2.56%降至42%±2.8%.

通过糖化酶的最适作用温度、pH及其稳定性研究,其酶学性质基本符合淀粉糖化工业化过程中对酶的要求,该酶比较适合应用于淀粉糖化工业.

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（责任编辑：邓天福）

（上接23页）

3结论

根据单因素试验和正交试验所得的数据,确定柠檬蜡伞多糖的最佳提取工艺为：液料比40∶1,提取温度85℃,提取时间90min,提取2次,在此条件下,多糖含量达4.412g/100g；各种因素对提取效果影响的主次顺序依次为：提取温度＞液料比＞提取时间；提取温度、提取时间对多糖得率的影响显著（P<0.05）；液料比对多糖得率的影响不显著（P>0.05）.本实验结果可为柠檬蜡伞多糖的分离纯化及活性研究提供科学的理论依据.

参考文献：

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