篇一：细菌生长曲线

实验九测定细菌生长曲线

[实验目的]1．了解细菌生长曲线特征：2．学习液体培养基的配制以及注意事项。3．学习液体种子和固体种子的不同接种方法和注意事项。4．利用细菌悬液浑浊度间接测定细菌生长。

[仪器和材料]

1．实验材料

(1)大肠杆曲，枯草杆曲培养液及大肠杆菌平板。

(2)牛肉膏蛋门胨葡萄糖培养基(150ml／250ml三角瓶x4瓶／大组)，配方：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，葡萄糖10g，加水至1000ml，ph7．5。

2．实验仪器

取液器(5000μl，1000μl，200tμl各一支)；培养箱．摇床，722s分光光度汁；1000μl无菌吸头100个；5000μl 无菌吸头2(:细菌生长曲线的测定实验报告)个；1ml或4ml 玻璃或塑料比色皿4个，共用参比杯一个。

[实验原理]

将一定量的细菌接种在液体培养基内．在一定的条件下培养，可观察到细菌的生长繁殖有一定规律性，如以细菌活菌数的对数作纵坐标，以培养时间作横坐标，可绘成一条曲线，称为生长曲线(图91)。

单细胞微生物发酵具有4个阶段，即调整(迟滞期)、对数期(生长旺盛期)、平衡期(稳定期)、死亡期(衰亡期)。

生长曲线可表示细菌从开始生长到死亡的全过程动态。不同微生物有不同的生长曲线，同一种微生物在不同的培养条件下，其生长曲线也不一样。因此，测定微生物的生长曲线对于了解和掌握微生物的生长规律是很有帮助的．测定微生物生长曲线的方法很多，有血细胞计数法，平板菌落计数法，称重法和比浊法等。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与浑浊度成正比，因此，可以利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度。将所测得的光密度值(测oD550或oD620或oD600或oD420，可任选一波长)与对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。注意，由于光密度表示的是培养液中的总菌数，包括活菌与死菌，因此所测生长曲线的衰亡期不明显。

从生长曲线我们可以算出细胞每一次所需要的时间，即代时，以g表示。其计算公式为；

g=(t2-t1)/[(1gw1—lgw2)／lg2]

式中tl和t2为所取对数期两点的时间；w1和w2分别为相应时间测得的细胞含量(g/L)或oD。

[实验步骤]

1．准备菌种：将大肠杆菌，枯草杆菌分别接种到装有牛肉膏蛋白胨葡萄糖培养基的三角瓶中，37℃，200r／min 振荡培养14-18h．另外准备大肠杆菌单菌落平板l块(37c 培养24h)。

2．接种：分别将1．5ml(1％接种量)和4-5ml(3％接种量)大肠杆菌菌液和一个大肠杆菌单菌落接人含150ml培养液的三角瓶中．37℃，200r／min振荡培养；把4．5ml枯草杆菌(3%接种量)接入含150ml培养液的三角瓶中，37℃，200r ／min振荡培养。

3．测量；每培养1h取样一次．净培养(不包括取样时间)10h结束培养，测量培养液ph值。零小时也要测。

如果选用4ml比色皿取500μl培养液到2000μl蒸馏水中(稀释5倍)，以蒸馏水为对照，测oD650。或oD620或oD600或oD420任选一波长)，如果选用lml比色皿，可以取1000μl培养液，以蒸馏水为对照，直接测oD620、oD600或oD420(任选一波长)，当oD值大于0.6时，下一样品要稀释1倍测量．

[实验结果]．

b.subtilis3%61.72;e.coli(plate)35.61。②液体种子比较均匀，用相同的液体培养基转接后条件变化小，因此迟缓期几乎没有出现；实验结果代时长于理论值，主要是实验条件的影响，培养基、接种量、培养容器、温度条件等均影响到理论值。

e.coli/b.subtilis生长曲线比较

1.81.61.41.210.80.60.40.20

12345671011时间(h)

[试验讨论]

(1)全班同时取样，

时间以教室挂钟为准，取样时间越短越好，要求在

10~15min内完成)，同时开始振荡，取样期间假定细菌暂停生长．取样时间从发酵总时间中扣除．

(2)为减少误差，须固定参比杯，不要旋动波长旋钮；每组固定同一台分光光度计，固定同一取液器oD(600nm) 篇二：微生物大实验实验报告(自动保存的)

民族大学生命与环境科学学院

微生物综合性设计实验报告

化学抑杀菌剂的效果评价evaluationofbactericideeffectofchemicalinhibition20 XX年11月30日

卡那霉素、氨苄青霉素和四环素对细菌抑杀效果的评价杨芳

（民族大学生命与环境科学学院北京100081）

摘要：目的了解抗生素对微生物生长的影响，学习抗菌谱试验的基本方法；自主设计方案，掌握评价化学抑杀剂作用效果方法；掌握评价化学抑杀剂作用效果方法。方法本实验主要采用倾注法测菌悬液浓度、滤纸片法测定抗生素的最小抑制浓度（mIc）及ph值对抗生素作用效果的影响和t检验法对实验结果进行统计学分析。结果本次试验所用大肠杆菌和枯草芽孢杆菌菌悬液浓度分别为1.3?107cFu/mL、

7.1?107cFu/mL；对大肠杆菌卡那霉素、氨苄青霉素和四环素的mIc分别为0.006mg/mL、0.098mg/mL和0.781mg/mL，对枯草芽孢杆菌卡那霉素、氨苄青霉素和四环素的mIc分别为0.024mg/mL、0.391mg/mL和0.195mg/mL；卡那霉素对大肠杆菌为杀灭作用，对枯草芽杆菌为抑制作用、四环素对大肠杆菌为抑制作用，对枯草芽孢杆菌为杀灭作用、青霉素对枯草芽孢杆菌为抑制作用，因大肠杆菌出现抗性，所以青霉素对大肠杆菌的作用不明显。结论对同一药剂，低浓度的药剂对细菌抑杀效果不明显而随着浓度的增大其抑杀效果越来越明显；同一浓度的同一药剂对不同细菌有不同的抑杀效果；不同药剂对同一细菌的抑杀效果是不同的。

关键字：最小抑制浓度；抗生素；大肠杆菌；枯草芽孢杆菌

Kanamycin,ampicillinandtetracyclineevaluationofthe inhibitionofbacterialkillingeffects

Yangfang

(collegeoflifeandenvironmentalscience,minzuuniversi tyofchina,beijing,100081)

Abstract：objectiveunderstandtheimpactofantibioticsonmicrobia lgrowth,learnbasicmethodsofspectrumantimicrobialtes ting;designindependently,masterevaluateeffectsofche micalagentstokillsuppressionmethods;graspevaluateef fectsofchemicalagentstokillsuppressionmethods.metho dsThisexperimentmeasuredusepourbacterialsuspensionc oncentration,filterpaperassayantibioticminimuminhib itoryconcentration(mIc)andtheeffectofphontheeffects ofantibioticsandt-testoftheexperimentalresultswerea nalyzedstatistically.ResultsThetestsusedescherichia coliandbacillussubtilisbacteriasuspensionconcentrat

ionwas

1.3?107cFu/mL,7.1?107cFu/mL.escherichiacolikanamyci n,ampicillinandtetracyclinemIcwas0.006mg/mL,0.098mg /mLand0.781mg/mL.bacillussubtilis,kanamycin,ampicil linandtetracyclinemIcwas0.024mg/mL,0.391mg/mLand0.1 95mg/mL;kanamycinkillingeffectone.coli,bacillussubt ilisfortheinhibitionofe.colitetracyclineinhibitiono fbacillussubtilistokill,penicillinistheinhibitionof bacillussubtilis,escherichiacolioccurduetoresistanc e,sotheroleofescherichiacolipenicillinisnotobvious. conclusionsForthesamedrug,alowconcentrationofdrugsu ppressionkilllittleeffectonbacteriaandwiththeincrea singconcentrationofitssuppressionkillmoreandmoreobv iouseffect;samedruginthesameconcentrationof

differentsuppressionkillbacteriahavedifferenteffect s;differentagentsofthesamesuppressionofbacterialkil lingeffectsaredifferent.

Keywords:mIc;Antibiotic;e.coli;bacillussubtilis

一、引言：

1.实验目的：1.1了解抗生素对微生物生长的影响，学习抗菌谱试验的基本方法；

1.2巩固已学习的微生物实验技能，学以致用；

1.3自主设计方案，通过滤纸片法研究一些常用抗生素的抑杀菌效果，掌握评价化学抑杀剂作用效果方法；

1.4掌握评价化学抑杀剂作用效果方法；

1.5培养学生的团队合作意识；

1.6培养学生总结实验结果和撰写科研论文的能力。

2.实验原理：

2.1抗生素

在人们日常生活中常用到各种抗病原体药物，包括各种抗生素和中药类复方抗菌药物等。抗生素是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）产生、能抑制或杀灭其他微生物的物质。抗生素既不参与细胞结构也不是细胞内的贮存性养料对产生菌本身无害但对某些微生物有拮抗作用，是微生物在种间竞争中战胜其他微生物保存自己的一种防卫机制。

抗生素分为天然品和人工合成品，前者由微生物产生，后者是对天然抗生素进行结构改造获得的部分合成产品。

2.1.1本次实验所用抗生素及其作用原理：

氨苄青霉素：抑制细胞壁中肽聚糖的合成；

卡那霉素：一种蛋白质生物合成抑制剂，通过与30s核糖体结合从而致使mRnA密码误读；

四环素：与核蛋白体的30s亚单位结合，而阻止氨酰基tRnA同核蛋白体结合，从而抑制肽连的增长和影响细菌蛋白质的合成；

2.1.2抗生素具有不同于化学药物的特点：

抗生素则能选择性地作用于菌体细胞DnA、RnA和蛋白质合成系统的特定环节，干扰细胞的代谢，妨碍生命活动或使停止生长甚至死亡抗生素的抗菌活性主要表现为抑菌、杀菌和溶菌三种现象。抗生素抗菌作用的表现与使用浓度、作用时间、敏感微生物种类以及周围环境条件都有关系。

抗生素的作用具有选择性，不同抗生素对不同病原菌的作用不一样。对某种抗生素敏感的病原菌种类称为该抗生素的抗生谱（抗菌谱）。

广谱抗生素对多种病原菌有抗生作用，例如青霉素对多种革兰氏阳性细菌都有良好药效，链霉素对多种革兰氏阳性和阴性细菌都有良好药效，对结核杆菌有特殊的疗效。

有效作用浓度。各种抗生素一般都在很低浓度下对病原菌就发生作用，这是抗生素区别于其他化学杀菌剂的又一主要特点。

各种抗生素对不同微生物的有效浓度各异，通常以抑制微生物生长的最低浓度作为抗生素的抗菌强度简，称有效浓度。有效浓度越低，表明抗菌作用越强。

有效浓度在100mg/L以上的属于作用强度较低的抗生素；

有效浓度在lmg/L以下是作用强度高的抗生素。

2.1.3抗生素的作用机制：

抑制细胞壁合成（青霉素、头孢菌素、杆菌肽）；

干扰细胞膜（多粘菌素）；

抑制蛋白质合成（与50s（30s）核糖体结合，氯霉素，红霉素）；

抑制DnA复制（丝裂霉素）；

抑制RnA转录或合成（放线菌素D、利福平）。

2.1.4细菌对抗生素（包括抗菌药物）的抗药性的4种

机制

使抗生素分解或失去活性：细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细菌内的抗生素使之失去生物

活性。

使抗菌药物作用的靶点发生改变：由于细菌自身发生突变或细菌产生某种酶的修饰使抗生素的作用靶点（如核酸或核蛋白）的结构发生变化，使抗菌药物无法发挥作用。

细胞特性的改变：细菌细胞膜渗透性的改变或其它特性的改变使抗菌药物无法进入细胞

篇三：福建农林大学微生物综合实验实验报告

《微生物综合实验》报告册

专业20XX级生物科学（生物学基地班）学号

姓名

生命科学学院

二o一六年六月

实验一、细菌的分离与纯化

一、实验目的

1、掌握培养基的作用和nA培养基的配制

2、熟练掌握无菌操作技术（灭菌锅和超净工作台）

3、掌握分离纯化菌种（涂布平板法和划线分离法）

4、了解菌种保种的方法

二、实验原理

1、培养基是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料,一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。nA培养基主要成分为：牛肉膏、蛋白胨和nacl。蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源；氯化钠能维持均衡的渗透压并提供微生物生长所需的矿物元素之一——钠离子；需要时可以使用琼脂作为培养基的凝固剂。

2、从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。试验中通过选用某种分离的方法在平板上进行操作，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法。

三、实验材料

1、菌种：待分离纯化的菌

2、实验药品：牛肉膏，蛋白胨，nacl，去离子水，琼脂（或琼脂粉）

3、实验器材：电子天平，超净工作台，恒温培养箱，摇床，灭菌锅，试管，试管塞，锥形瓶，玻璃棒，封口膜，烧杯，培养皿，接种环，酒精灯，移液，头，1.5mL离心管

四、实验步骤

1.制备培养基

nA培养基配方（g/L）：牛肉膏3g

蛋白胨10g

nacl5g

（固体培养基需要加入琼脂15g/L，ph=7.3±0.1）

依次称取蛋白胨、牛肉膏和nacl到烧杯中，取所需水量的一半放入烧杯中溶解，用naoh调节ph至7.3，最后补足水量（若配固体培养基则另加琼脂粉），培养基经分装包扎之后，立即进行高压蒸汽灭菌，12l℃灭菌20min。

2、目的菌株的分离、纯化

（1）摇床培养：用接种环从长有未知菌的培养基中刮取未知菌到5mlnA液体培养基试管，摇床培养8-12小时以获得菌液。

（2）梯度稀释：吸取100ul上述菌液和900ulLb液体培养基在1.5ml离心管中

震荡混匀后获得终浓度为10-1的菌液；再将此菌液作为母液用上述方法进行稀释，震荡混匀后获得终浓度为10-2的菌液；此后都将新稀释的菌液作为母液，用上述方法进行稀释，震荡混匀后依次获得终浓度为10-1、10-2、10-3和10-4的菌液，同时将这四个菌液作为待纯化的菌液进行平板划线接种。

（3）倒平板：将nA固体培养基融化后，倒10～12mL

于灭过菌的培养皿中，待凝固。

（4）涂板分离：将不同浓度的菌液各自取150μL于nA 固体培养基中，用涂布器涂匀至干，正置5min，放入28度培养箱培养16-24h。

（5）划线分离：用接菌环去不同浓度的菌液分别于相对应的nA无菌平板上进行划线分离，左手取无菌平板一个，用拇指和食指控制皿盖，其余几指控制皿底，打开皿盖，使开口角小于30°，将接种环上的菌种按四个分区进行划线，一区法要求连续划线，且线的边缘应划至培养皿的内缘，线要紧密但不相连。三区或四区法要求每划完一区，都应灼烧接种环，后一区要求与前一区首尾相连，但不得与其他区域搭在一起。

（6）挑取菌株：从培养皿中刮取单菌落到5mlnA液体培养基试管中，培养8-12小时以获得菌液。

五、注意事项

1、配好的培养基应立即高压灭菌，防止杂菌生长，改变培养基的成分。

2、划线分离时及前后，接菌环要灼烧干净，防止杂菌污染。

3、由于放线菌菌丝致密不易挑起，故应连带培养基一起挑起于液态培养基培养，再进行划线分离或是涂布分离。

六、实验结果与讨论

1、实验结果

分离纯化：纯化培养：

2、讨论分析

从实验的结果上来看，基于实验所用的待测放线菌，划线分离的效率和获得单菌落的可能性都较大于涂布平板方法，仅有划线分离的平板上成功生长出单菌落。原因可能是由于放线菌在液体培养基中的菌丝抱团形成菌丝球在涂布

过程中难以被打开导致较难生成单菌落。而在平板培养过程中可以发现待测放线菌菌丝较细，生长缓慢，相互缠绕，形成的菌落质地致密、表面呈较紧密，菌落坚实较小而不蔓延。纯化培养如图，培养基澄清，细菌以菌丝球形式存在，都符合放线菌的特征，说明该步骤的分离和纯化是成功的。

实验二、细菌显微形态观察

一、实验目的

1、掌握革兰氏染色法鉴别细菌的原理及操作方法；

2、学会使用油镜观察细菌的形态，初步鉴定待测菌；

二、实验原理

革兰氏染色的差异主要是由于阴性与阳性细菌细胞壁

的差异所引起的。通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经番红等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

三、实验材料

1、菌种：在平板上生长16小时的待测菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。

2、试剂：无菌水，草酸铵结晶紫染液，碘液，95%乙醇，番红染液，液体石蜡。

3、实验器材：普通光学显微镜，超净工作台，灭菌载玻片，吸水纸，擦镜纸，接种环，酒精灯，打火机，计时器。

四、实验步骤

1.革兰氏染色确定待测菌的阴阳性

（1）涂片：取灭过菌的载玻片于超净工作台上，并滴一小滴无菌水在载玻片的，再用烧红冷却后的接种环挑取单菌落至无菌水滴中，并涂抹成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。

（2）干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。

（3）固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2~3次，共约2~3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。

（4）初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。

（5）水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

（6）媒染：用碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。

（7）水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

（8）脱色：斜置载玻片，滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，用时不能超过20秒，随即水洗。

（9）复染：在涂片薄膜上滴加番红染液1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约2min。

（10）水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

（11）干燥、观察：用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后滴一滴液体石蜡在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色,紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌。

2.纯度检查

在革兰氏染色之后，随机观察五个视野，菌的形态一致，即为纯菌。

五、注意事项

1、干燥时，应将载玻片置于酒精灯上方稍稍加热，加热时间不能过长，应以载玻片背面不烫手为宜。

2、选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。

3、涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。

4、脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成

假阳性，脱色过度造成假阴性。在用95%乙醇脱色时，应将

旁边的酒精灯熄灭或原理酒精灯操作，以防95%乙醇挥发着火。且脱色时间应不超过20s，脱色过程中前5s应使乙醇浸没涂片，随后开始用乙醇冲洗。

5、复染所用的番红染液浓度不宜过高，若染液浓度较高，可适当缩短染色时间，以防镜检时，对细菌的颜色观察造成影响。

6、每次水洗过后用吸水纸吸掉涂片上的水滴时，将吸

水纸覆盖在涂片上轻轻稍按压使水分吸干即可，动作要轻柔，不能用力擦拭，以防被固定的涂片被擦拭掉。

六、实验结果与讨论

1、实验结果

2、分析和讨论

（1）由上三图对比可得待测放线菌呈紫色，与葡萄球

菌同属于革兰氏阳性菌。此结果可于后期实验五测序对比得知待测菌种后再次验证。

（2）染色中由于番红染液可能的浓度差异，导致了镜

检时阳性菌（葡萄球菌和待测放线菌）除了紫色以外还附着过多的红色，所以复染的步骤不应局限于实验步骤所提供的时间，必要时候须进行多次的重复实验以获得较好的镜检结

果。

（3）由于放线菌菌丝质地致密，涂片时需要仔细耐心

地将菌落涂开，以观察到细致的待测放线菌视野，不然容易

出现菌体高密度凝聚导致无法观察菌体特征。

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