实验简介：细胞融合(cell fusion)又称体细胞杂交，是指采用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后异核体细胞同步进入有丝，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因重组形成只有一个细胞核的杂种细胞(hybrid cell)。本实验采用鸡红细胞和大鼠红细胞为研究对象，在融合剂聚乙二醇(PEG)的作用下，促使鸡-鸡红细胞、鸡-鼠红细胞等发生融合。实验学时3 个。 

一、实验目的 

1.了解 PEG 诱导细胞融合的基本原理。 

2. 通过 PEG 诱导的鸡红细胞之间或鸡红细胞与大鼠红细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合技术。 

二、实验原理 

两个以上细胞合并成一个双核或多核细胞，称为细胞融合(cell fusion)。细胞融合包括质膜的连接与融合，胞质合并，细胞核、细胞器和酶等互成混合体系。细胞融合技术广泛应用于细胞生物学、遗传学、病毒学、肿瘤学的研究。例如，细胞周期的研究，基因互补分析、检测病毒，细胞对病毒敏感因素的分析、 肿瘤细胞恶性分析等等。 单克隆抗体技术就是通过细胞融合技术发展起来的，对生命科学的研究及医学方面的应用产生了重大影响。 

化学融合剂聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体。PEG 可与水分子借氢键结合，在高浓度(50％)的 PEG 溶液中自由水消失， 导致细胞脱水而发生质膜结构的变化， 引起细胞融合。为了发挥 PEG 促进细胞融合的效力，必须采用较高浓度的 PEG 溶液，但在高浓度PEG 溶液下，细胞可能因脱水而受到显著的破坏。因此，选择合适的分子量、浓度及作用时间是 PEG 融合技术的关键。  

三、实验用品 

（一）材料  新鲜鸡血，大鼠若干只。

（二）器材  离心机、显微镜、天平、水浴锅、血球计数板、滴管、离心管、

容量瓶、广口瓶、细口瓶、烧杯、注射器、盖玻片、载玻片。

（三）试剂 

1. Alsever 溶液：葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.80g，NaCl 0.42g，溶于100ml双蒸水中。 

2. 0.85％生理盐水。 

3. GKN 溶液：NaCl 8g，KCl 0.40g，Na2HP04·2H2O 1.77g，NaH2P04.H2O 0.69g，葡萄糖 2g，酚红 0.01g，溶于 1000ml 双蒸水中。 

4. 1%詹纳斯绿 B 溶液（原液） ：称取 50mg 詹纳斯绿 B 溶于 5ml Ringer 氏液，稍加微热(30～40℃)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为 1％原液。 

5. 詹纳斯绿 B 溶液（应用液） ：取 1％原液 1ml 加入 49ml Ringer 溶液, 混匀即可。现用现配。 

6. 50％PEG 溶液：称取一定量 PEG(WM：4000)放入烧杯，沸水浴加热，使之熔化，待冷却至 50℃时，加入等体积预热至 50℃的 GKN 溶液，混匀，置 37℃备用。 

7.Ringer 氏液 

氯化钠              0.85g 

氯化钾              0.25g 

氯化钙              0.03g 

蒸馏水              100ml  

四、实验操作    

1. 红细胞的制备 

(1) 鸡血红细胞的制备  注射器内先吸入 2ml Alsever 溶液，从鸡翼下静脉取 2ml鸡血，注入离心管，再加入6ml Alsever 溶液，使之成为 1：4 悬液。

(2) 取 lml 鸡血悬液，加入 4ml 0.85％生理盐水，混匀平衡后，800r／min离心 3min，弃去上清液，再按上述条件离心 2 次。最后，弃去上清液，加 GKN液 4ml，离心1 次。 

(3) 弃去上清液，加 GKN 液(体积比 1：9)，制成 10％细胞悬液。

(4) 大鼠血红细胞的制备  左手抓住大鼠，将大鼠头部向下，右手持尖头镊子，轻轻将镊子插入大鼠眼眶内，然后将眼球向外拉出，此时流出的血液置于预先盛有 10ml Alsever溶液的烧杯中，操作顺利的话，可以得到 6～10ml 大鼠血。然后按上述鸡血红细胞制备的方法制成 10％细胞悬液。

2. 细胞计数  取以上悬液以血细胞计数器计数，若细胞密度过大，用 GKN溶液稀释至(3～4)×107个／ml。 

3. 温育  取以上细胞悬液 lml于离心管，放入 37℃(39℃左右更佳)水浴锅中预热。同时将 50％PEG 液放入水浴锅中预热。 

4. 融合 

（1） 待温度恒定后， 在lml细胞悬液中慢慢逐滴加入0.5ml 50％PEG溶液(慢慢沿离心管壁流下融合剂)，且边加边摇匀，然后放入水浴锅中。 

（2）细胞融合一段时间(20～30min)后，加入GKN 溶液至 8ml，静止于水浴锅中 20 min 左右。 

（3）取出离心管，800r／min 离心 3 min，使细胞完全沉降。弃去上清液，加 GKN 溶液，再离心 1 次。 

5.染色  弃去上清液，加入少量GKN 溶液，混匀，取少量悬液于载玻片上，加入 Janus green 染液小半滴，用牙签搅匀，3min 后盖上盖玻片，观察细胞融合情况。 

6.实验设计  实验共分为三种融合方式进行，即鸡红细胞－鸡红细胞、大鼠红细胞－大鼠红细胞、鸡红细胞－大鼠红细胞融合，每位同学可选 1～2 融合方式进行实验。

五、结果   

1.在显微镜下，观察细胞融合情况，计算融合率。 

2.融合率=视野内发生融合的细胞核总数／视野内所有细胞核总数×100％  

六、注意事项 

1.影响细胞融合的因素很多，其中对 PEG 的要求更严格。实验时最好选择分子量在 1500～6000（视细胞种类不同来定，也可参考文献）；PEG 的浓度以 50%为好。PEG 以国外产品质量为先；同时尽可能选择近期供应的商品；

2.细胞融合对温度很敏感，过高过低的温度均不利于融合。实验最佳温度应控制在 37℃～39℃范围内。 

3. PH 也是影响细胞融合成功与否的关键因素之一。所配的试剂溶液 PH 值

应控制在 7.0～7.2。 

4. 为了便于观察到细胞融合的形态，需要对细胞进行染色。除Janus green  4

染液外，也可选择HE 染色或姬姆萨染液。 

七、作业 

1.  书写实验报告，并计算融合率。 

2.  绘图显示所观察到的融合细胞。 

3.  在进行细胞融合时，要注意哪些问题?下载本文