方法

1测定土壤及植物水状况

（1）按照Barrs和Weatherley（1962）的方发测定叶片RWC（相对含水量）。在DAP（开花后的天数）分别为22，24，26和28时，每日10：00-11：00之间取样，每次取两片新近成熟的叶片→称重→将样品浸入蒸馏水中，在室温下浸润4h→在80℃下烘干48小时并在植物材料焦化前称重。（2）计算叶片的WC（自然含水量），其分母为叶片的鲜重。

（3）土壤WC的测定用传统的重量分析方法。在DAP为22，24，26和28时16：00从花盆的中心取样→称湿重→80℃下烘干48小时。

Notice 1RWC计算：RWC=（Wf－Wd）／（Wt－Wd）×100%

2WC计算：WC=（Wf－Wd）／Wf×100%

Wf：叶片鲜重；

Wd：叶片干重；

Wt：叶片吸水饱和时的重量。

2酶粗提液的制备

为了测定CAT，POD和SOD，取叶片0.5g(f.wt)→于6ml，50mM冰冷的磷酸钠缓冲液（含0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.0），冰浴研磨→匀浆用4层纱布过滤→以每分钟15000g，4℃，离心20min→取上清。上清液可用来测量酶活性（Zhang和Kirkham，1994）。

为了测定AP，DR，MR和GR，取叶片0.7g(f.wt)→于8ml，25mM冰冷的磷酸钠缓冲液（含0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.8），冰浴研磨→过滤匀浆→以每分钟18000g，4℃，离心15min→取上清。上清液可用来测量酶活性（Cakmak，Strbac和Marschner，1993）。

试剂：磷酸钠缓冲液（含0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.0）。

3酶活性的测定

所有的分光光度分析都使用Hitachi U-2000型分光光度计。

3.1SOD总活性的测定按照Giannopolitis和Ries（1977）的方法略作修改（Chowdhury和Choudhuri，1985；Zhang et al。，1995）。3ml反应混合液中含63μM的NTB，1.3μM的核黄素，13mM的蛋氨酸，0.1mM的EDTA，50mM的磷酸缓冲液（pH7.8）和20μL酶液。核黄素应最后添加。将盛有反应混合液的试管放置在两盏4000lux荧光灯下，打开荧光灯，反应开始，照光10min，关闭荧光灯，反应终止，马上测定它在560nm处的吸光度。不照光的反应体系在560nm处的吸光度作为对照，并将之从A560中减去。不加酶液的反应体系颜色最深，说明NTB被还原量最大。NTB的光还原量与SOD的活性呈反比。SOD酶活性采用抑制NBT光还原50%为一个酶活单位。

Notice：不加酶液的反应体系，以缓冲液代替酶液，其560nm处的吸光度作空白。

试剂：63μM的NTB，1.3μM的核黄素，13mM的蛋氨酸，0.1mM的EDTA，50mM的磷酸缓冲液（pH7.8）

试剂：NTB，核黄素，蛋氨酸，EDTA，磷酸缓冲液（pH7.8）

3.2CAT与愈创木酚POD活性按照Chance和Machly的方法测定（1955）。对CAT来说，其活性可以根据反应混合液1min内在240nm处的吸光度随着H2O2的分解而降低程度来确定（ε=39.4M－1cm－1，Chance和Machly，1955）。反应混合液包含50mM磷酸缓冲液（pH7.0），15mMH2O2，0.1ml酶液。加入酶液反应即开始。对POD来说，其活性可以通过测定反应混合液在460nm处的吸光度在1min内因愈创木酚的氧化作用而增加来确定（ε=26.6M－1cm－1，Chance和Machly，1955）。反应混合液包含20mM愈创木酚50μl，10mM磷酸缓冲（pH7.0）2.83ml，0.1ml酶液。加入40mMH2O220μl后反应开始。

试剂：H2O2，愈创木酚

3.3AP的活性可以根据反应混合液在290nm处的吸光度在1min内降低程度来确定（ε=2.8mM－1cm－1，Nakano和Aasda，1981）。反应混合液包含0.5mMAsA,0.1mMH2O2,0.1mMEDTA,50mM磷酸钠缓冲液（pH7.0），0.15ml酶液。加入H2O2后反应开始。该反应速率可以通过减去未加酶液反应体系的反应速率进行校正。

3.4GR活性可以通过检测反应混合液在340nm处的吸光度1min内因NADPH氧化而降低的程度来确定（ε=6.2mM－1cm－1，Cakmak et al.,1993）。反应混合液包含1mMEDTA，1mMGSSG，0.2mMNADPH，0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.8），0.15ml酶液。加入GSSG后反应开始。

3.5DR活性可以通过检测反应混合液在265nm处的吸光度因AsA形成而引起的变化来确定（ε=14mM－1cm－1）。反应混合液体包含2.5mMGSH，0.1mMEDTA，0.2mMDAsA，50mM磷酸钠缓冲液（pH7.0），0.2ml酶液（Nakano和Asada，1981；Cakmak et al.，1993）。反应时间为1min。加入DAsA后反应开始。通过减去未加酶液的反应体系吸光度进行校正。

试剂：GSSG，NADPH，磷酸钠， GSH，DAsA

3.6MR活性可以通过检测反应混合液在340nm处的吸光度在30s内的改变来确定（ε=6.2mM－1cm－1）。反应混合液体积为3ml，包含0.1mMNADH，2.5mMAsA，50mM磷酸钠缓冲液（pH7.6），4单位AsA氧化酶，0.15ml酶液（Hossain，Nakano和Asada，1984；Cakmak et al.，1993）。加入AsA后反应开始。通过减去未加AsA氧化酶反应体系的吸光度进行校正。

3.7酶的粗提液中蛋白质含量按Bradford的方法的测定，以BSA作标准。

试剂：AsA氧化酶，BSA

4抗坏血酸和谷胱甘肽的提取与分析

取1g叶片材料置于10ml5%冷的偏磷酸中匀浆，以备测量AsA，DAsA，GSH和GSSG时使用。匀浆液在4℃，22000g／min，离心15min。取上清，并用之分析抗坏血酸和谷胱甘肽。

4.1AsA，DAsA和总的抗坏血酸（AsA+DAsA）含量按Law，Charles和Halliwell（1983）的方法测定。在测定总抗坏血酸含量时，一般先用DTT将DAsA还原为AsA。DAsA含量通过总抗坏血酸含量与AsA之差来计算。测定总抗坏血酸含量的反应混合液包括上清液0.3ml，150mm磷酸缓冲液0.78ml（含5mMEDTA，pH7.4）和10mMDTT0.15ml。将反应液在室温下放置10min，然后加入0.5%N-乙基马来酰亚胺0.15ml除去过剩的DTT。检测AsA的反应体系与上述混合液相似，只是多加0.3mlH2O，不加DTT和N-乙基马来酰亚胺。接着在以上两反应体系分别加入以下试剂：6%TCA0.6ml，44%正磷酸0.6ml，4%α,α′-双吡啶（溶剂为70%乙醇）0.6ml，0.3%α,α′-双吡啶（w/v）。加入以上试剂以后。反应混合液后，颜色都有所增加。将反应混合液涡漩混匀，40℃下温育40min，然后测量其在525nm处的吸光度。绘制0-100μgAsAml－1的标准曲线。

试剂：偏磷酸，DTT，N-乙基马来酰亚胺，正磷酸，α,α′-双吡啶，α,α′-双吡啶

4.2GSH和GSSG含量根据Griffith（1985）Smith（1985）的方法测定。1ml上清液加入0.5M磷酸缓冲液1.5ml中和（pH7.5），随后加入50μl的H2O。上述溶液用来测定总谷胱甘肽（GSH+GSSG）的含量。另取1ml上清液，加入0.5M磷酸缓冲液1.5ml中和（pH7.5），并加入2-乙烯吡啶50μl，以掩盖GSH，然后将试管中的溶液混匀，直到形成乳浊液。将试管于室温下温育60min。上述溶液用来测定GSSG的含量。GSH含量即是总谷胱甘肽含量与GSSG之差。测定GSH含量的反应混合液含0.2mMNADPH，100ml磷酸缓冲液(pH7.5)，5mMEDTA,0.6mMDTNB，3单位的GR。加入0.1ml上清液后反应开始。其反应速率可以通过测量反应混合液在412nm处的吸光度1min内的变化来进行检测。绘制0-100μgGSHml－1的标准曲线。

试剂：2-乙烯吡啶，GR

5测定脂质过氧化作用

一般通过硫代巴比妥酸反应测定的MDA量来确定脂质过氧化作用的程度。MDA含量按照Dhindsa，Plumb-Dhindsa和Thorpe（1981）方法测定。取0.4g叶片（f.wt）加6ml的1%TCA搅匀。匀浆以10000g/min离心10min。取1ml上清液加入20%TCA4ml，其中包括0.5%硫代巴比妥酸。混合液在此95℃加热30min，在一冰盒中迅速冷却。试管以10000g/min离心10min，然后测定上清液在532nm处的吸光度，并从中减去其在600nm非特异性吸光度。MDA含量的计算是通过其消光系数为155mM－1cm－1来计算的（Heath和Packer,1968）。

试剂：TCA，硫代巴比妥酸

6测定色素含量

取0.4g叶片（f.wt）在8ml8%丙酮中研磨。匀浆以2700g/min离心10min。测定上清液在663.2nm，6.8nm和470nm处的吸光度。Chla，Chlb及总Car（包括叶黄素和β-胡萝卜素）含量根据Lichtenaler（1987）公式来计算：

Ca=12.25A663.2－2.79A6.8

Cb=21.50A6.8－5.10A663.2

Cx＋a=（1000A470－1.85Ca－85.02Cb）／198，

Ca，Cb和Cx＋a分别代表Chla，Chlb及总Car含量（μlml－1植物提取液）。

试剂：丙酮

Acclimation of leaf carotenoid composition and ascorbate levels to gradients in the light environment within an Astrialian rainforest

方法

1色素分析

Chl和Car提取按照Adams和Demmig-Adama（1992）方法进行，分析则根据Gilmore和Yamamoto（1991）介绍的HPLC方法并稍作修改进行，方法如下：每分钟增加溶液A（乙腈-甲醇-Tris-HCl缓冲液100molm－3，pH8，78∶8∶3）1.0cm－3，并一直持续到7.5min，然后马上改为添加100%溶液B（甲醇-己烷，4∶1）萃取剩余物。这种方法可以使各种色素完全分离，包括叶黄素与玉米黄质。我们可以使用经丙酮萃取并用薄层层析法分离的叶片色素进行校正[TLC平板，Art 5553 DC Alufolien Kieslgel，Merck，Darmtadt；溶液，53%石油醚（b.p.=37-57℃），41%氯仿，6%异丙醇。将洗脱的色素过滤，用分光光度计确定其数量，然后将其径直注射入HPTC。

通常，将一枚叶片分成三等分份分别测量色素组成，然后取其平均值。

试剂：乙腈，甲醇，Tris，HCl，己烷，石油醚，氯仿，异丙醇

2抗坏血酸分析

还原型抗坏血酸总量的测定根据Wise和Naylor方法，并稍加修改。方法如下：将组织在1.25cm3冷的0.55kmol m－3HClO4中研磨，并立即以10000g离心，这样可以除去组织碎片。取500mm3上清液，加入200mol m－3琥珀酸-KOH缓冲液2.5cm3，pH12.6，由于引起反应，混合液的最终pH5.6。然后立即测量它在2nm处的吸光度。25min后加入5U的抗坏血酸氧化酶。抗坏血酸浓度可以通过不同浓度抗坏血酸绘制的标准曲线来确定。

试剂：HClO4，琥珀酸-KOH

Effect of photoinhibitioy treatment on CO2  assimilation，the quantum yield of CO2  assimilation，D1 protein，ascorbate，glutathione and xanthophyll contents and the electron transport rate in vine leaves

1Chl与Car的测定

叶片摘取后速冻于液氮中，然后在－80℃50mg下储藏待用。取大约50mg（f.wt）于盛有液氮和50mgNaHCO3的研钵中研磨，然后用含50体积丙酮、30体积甲醇和20体积石油醚混合液进行萃取。提取液以16000g/min离心5min，取上清，将之于冰上保存。沉淀用上述溶液重新悬浮离心。重复这一过程，直到上清液为无色为止。将最后得到的上清液用孔径为5μm过滤器进行过滤，并将滤液进行蒸发。得到的干物质用氩汽沸腾后在黑暗中于20℃贮存。Car通过Gilmor和Yamamto描述的不含水的反相高效液相色谱仪进行检测。

试剂：液氮

Diurnal fluctuation of antioxidative systems in leaves of field-grown beech trees

Plant aging increases oxidative stress in chloroplasts

1生育酚的测定

叶子采摘时间分别为黎明前（太阳升起前1h）、正午（具有最大入射的PPFD）和傍晚（太阳落山后1h）。摘后速冻于液氮中，并在80℃储存，以待检测。生育酚的提取与测定按照Munné-Bosch方法不同之处只是在于提取过程中将丙酮换成了N-己烷。总之取500mg叶片在研钵中研磨,然后利用超生波粉碎技术用含有1μg ml－1BTH的N-己烷反复提取（Vibra-Cell Ultrasonic Processor）。生育酚的测定HPLC，它使用ODS Hypersil-5μm柱（色谱仪表430；Kontron）和乙腈/水（98∶2，v/v）（包含0.2%的2M拧檬酸作为洗脱剂）。生育酚含量可以通过检测它在295nm处的吸光度（Spectralphotometer 430；Kontron）和它经295nm激发后在340nm处荧光产量（荧光检测器材SFM 25；Kontron），生育酚用来校正（Sigma-Aldrich）

2色素检测

叶子采摘时间分别为黎明前（太阳升起前1h）、正午（具有最大入射的PPFD）和傍晚（太阳落山后1h）。摘后速冻于液氮中，并在80℃储存，以待检测。色素提取与分析按照Munné-Bosh 和Alegre(2000)。总之，取叶片500mg在研钵中研磨利用超生波粉碎技术用85%（w/w）和100%丙酮反复提取（Vibra-Cell Ultrasonic Processor；Sonics和Materials Inc.,Canbary,Conn.,USA）。色素用HLPC分析,使用Dupont nonencaped Zorbax-5μm柱（长为250nm，直径为4.6nm，20%C；TeKnokroma，St，Cugat，Spain），乙腈/甲醇（85∶15，v/v）和甲醇/乙酸乙脂（68∶32，v/v）分别作为洗脱液A和洗脱液B。浓度梯度为：0－14min，100%A；14－16min降低到0%A；16－28min，0%A；28－30min升高到100%A；30-38min，100%A。在450nm处进行检测（Spectralphotometer 430；Kontron，Zurich，Switerland）。混合物                

叶圆片培养：

直径1cm

70% 乙醇30s

培养液：4mM Ca(NO3)2, 2mM MgSO4, 1mM KH2PO4, 3mM NH4NO3

用CDNB法测定GST活性，反应液为：1 mmol/L CDNB, 0.1 mmol/L GSH, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 6.5), 1 mmol/L EDTA. 测定酶促反应（30℃）过程中340 nm 处消光度的增加，用消光系数ε= 9.6 mM-1cm-1计算CDNB的消耗量。用1 min.内1 mg 蛋白质催化1 μmol CDNB 的转化表示1个酶活性单位(U).

POD活性染色液： H2O2  0.1496g,  NaCl 29.25g,CoCl2  0.4759g,Tris 3.0273g, 调pH 5.0, 定容至500ml

CAT活性染色液：H2O2 0.15g, FeCl2 1.4g, K3Fe(CN)6 9.8g 定容至500ml

考马斯亮蓝G-250(100mg溶于95%乙醇50ml,加入100ml浓磷酸，  加入无离子水定容至1000ml

1.剪碎200g

2.20Mm Tris—acetate（pH7.4），18000rpm匀浆

3.8层纱布过滤，离心

4.DEAE-cellulose

5.调pH8

6.过人造沸石柱，洗去杂蛋白

7.6.4% NaCl洗脱下载本文