酵母菌的培养和观察
目的 认识酵母菌的形态特征，了解培养酵母菌的方法。
实验前的思考 人类认识和利用酵母菌的历史悠久，早在史前时期，先人们就学会酿酒。约在6000年前，就发明发面的方法。直到十九世纪有了显微镜，人们才窥探到醉母菌的真面目。对酵母菌做纯系培养分类研究的是与巴斯德同时代的丹麦人汉斯，他是为寻求酿造高品质啤酒的途径才去深入研究酵母菌的。
材料器具 甜酒酿汁液，新鲜酵母，豆芽；显微镜，载玻片，盖玻皮，玻璃棒，镊子，滴管，吸水纸，酒精灯，石棉网，火柴，漏斗架，玻璃斗，量杯，三角烧瓶，烧杯，天平，量筒，棉絮；蔗糖，乳酸，碘液。
步骤
1．观察酵母菌
（1）用滴管从甜酒酿的汁液中吸取一滴汁液，滴在载玻片上，用针摊开，盖上盖玻片，在低倍镜下就能清楚地看到甜酒酿的汁液中悬浮着无数酵母菌。再换高倍镜仔细观察一个酵母菌，可以看到酵母菌是椭圆形的单个细胞，细胞中有许多小颗粒，也有几个大的液泡（图示）。有的酵母菌的一端长出大小不同的突起，这是酵母菌的芽体。芽体成长脱落，就成为新的个体，有的芽体在从母体脱落前又长出突起。这种繁殖方法叫出芽繁殖。
（2）在盖玻片一边加一滴碘液，从另一边用吸水纸把染液引入盖玻片下。不久就能看到被染成棕褐色的细胞核和变成蓝紫色的淀粉粒。
2．培养酵母菌
（1）用蔗糖液培养 在盛有100毫升的三角烧瓶里加5克蔗糖，煮沸。等到溶液稍稍冷却，加一小块鲜酵母，用玻璃棒搅拌均匀；再用棉絮塞紧瓶口。然后把烧瓶放在 25～30℃的温暖地方，数小时后就可见到溶液里有气泡产生，并散发出酒味。这是因为酵母菌正在把糖分解成乙醇和二氧化碳。
（2）二三天后吸取溶液在显微镜下观察，就可看到已培养出大量酵母菌。
注意事项
1．观察酵母菌时，视野里杂质较多，有淀粉粒、半分解的淀粉团块、曲霉孢子和其它杂菌等等，只要掌握住酵母菌的形状和体内具有液泡，尤其是染色后体内具有褐色的核和蓝色的淀粉粒这些特点，就可以跟其它杂菌区分开来。
2．发酵在缺氧的环境里仍能良好地进行，不必为了增加氧气去搅拌已放入菌种的培养液。
分析和讨论
酵母菌是少数能在缺氧环境里生存较长时间的一种微生物，它属于兼性菌类。在一般情况下进行有氧呼吸。如环境中有丰富的糖类，它进行缺氧呼吸。其过程如下：
1．C6H12O6+6O2→6CO2+6H2O+2.87×103兆焦（有氧呼吸）
2．C6H12O6→2CO2+2C2H5OH+109×103兆焦（缺氧呼吸）
建议 培养酵母菌还可以采用下列两种方法。
1．用乳酸、豆芽汁和蔗糖液培养
（1）取10克豆芽放入100毫升水中，加热煮沸半小时，盛起，用细布过滤。在滤液里加5克蔗糖和5毫升乳酸，配成液体培养液。
（2）把鲜酵母半块或老面（发酵后晾干的面粉团）打碎，投入培养液中，放在黑暗温暖的地方，二三天后就可以培养出大量酵母菌。
2．用巴斯德培养液培养
酵母菌需要的无机营养来自外界环境。如果在培养液内适当增加氮、磷等元素，效果会更好。巴斯德培养液的配方如下：
蔗糖15克，碳酸铵1克，磷酸氢钾0．2克，磷酸钙0．02克，硫酸镁0．02克，蒸馏水100毫升，培养方法跟上述的相同。
于运联 中学生物学实验大全 1994年12月
酵母菌的培养与转形作用
Ⅰ.目的
酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）是一种很有用的真核生物，他拥有生物的特性，可用原核生物的方式培养，其基因组较小，复制时间短，可作为基因分析，在分子生物学研究上的突破，很多都是以它为材料。在工业上酵母菌也很重要，例如：啤酒、面包、酒、重组胜 和蛋白质之合成皆与酵母菌有关。
在重组DNA技术中，酵母菌（yeast）乃是一种很重要的寄主生物，可用质体DNA为媒介物引入外来DNA并表现之。转型技术与大肠杆菌相似，但其方法需修饰以瓦解其细胞壁，常用的两种方式进行酵母菌的转型作用，一是使酵母菌形成Spheroplast，此法较麻烦需将细胞壁去掉，另一种是用碱性阴离子（例如：LiCl或RbCl）加上热休克快速地处理完整的细胞，本实验用后者来实行，收集对数生长期的酵母菌细胞，经碱性阴离子及热休克处理，可使细胞外鞘发生变化，有利于吸收质体DNA，正如大肠杆菌一样（参照实验5），不同的因子会影响效率，质体DNA吸收能力与质体的大小、DNA的构形、寄主品系、筛选步骤有关，与大肠杆菌的转形作用相比有显着的差别是转形效率，酵母菌的转型效率在每1 mg质体DNA中，约可获取103-104转形细胞。
II.酵母菌的培养
1.仪器用具：
a. 30 ℃恒温箱
b. 酒精灯
c. 接种环
2.药品与试剂：
a. yeast 菌株：
EGY48〔MAT , ura3, his3, trp1, LexAop(x6)-LEU2〕
YM4271〔MATaura3-52, his3-200, lys2-801, ade2-101, ade5, trp1-901, Leu2-3,112, try1-501, gal 80gal 4ade5::hisG〕
Y187〔MAT, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801, trp1-901, Leu2-3,112,gal4, gal 80, cyhr2, LYS2::GALUAS-HIS3TATA-HIS3, URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-LacZ〕
Y190 [MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801, trp1-90, leu2-3, 112, gal4,gal80, cyhr2, LYS2::GAL1uas-HIS3TATA-HIS3, URA3::GAL1uas-GAL1TATA-lacZ]
b. YPD培养液、培养基（参照实验4）
3.方法与步骤：
１）单一菌落（single colony）之分离，请参照实验4。分别将酵母菌养于YPD培养液或培养基中，至于30 ℃之培养箱中约3-5天。
２）隔周实验前，取出酵母菌落并观察。
III.酵母菌转形作用
1.仪器用具：
a. 30 ℃培养箱
b. 离心机
c. 干浴器
d. 冰浴
2.药品与试剂：
a. minimal synthutic dropout（SD）base agar（clontech）
b. –Ura
c. 1 x TE/LiAc（0.1 M LiAc in TE溶液）
d. 40﹪PEG4000
e. DMSO
3.方法与步骤：
１）制备胜任酵母菌的前一天，接种酵母菌EGY48于3 ml YPD培养液中，置于30 ℃恒温箱中振荡培养（230-250 rpm）过夜。
２）准备10 ml YPD培养液，加入300 l过夜菌液，使OD600 = 0.4~0.6。
３）在室温下以2200 rpm离心5分钟，倒去上清液，加入5 ml水悬浮酵母菌。
４）在室温下以2200 rpm离心5分钟，倒去上清液，加入新鲜的100 l 1 x TE-LiAc悬浮。
５）加入0.1~0.5 g p8OP-LacZ质体DNA及0.1 mg片段精子DNA携带者。
６）加入600 l PEG-LiAc（0.1M LiAc, 40﹪PEG in TE）混匀，置于30 ℃恒温箱中振荡培养（200 rpm）30分钟。
７）加入70 l DMSO，混匀并热休克42 ℃ 15分钟，迅速至于冰浴中2分钟。
８）在室温下以14,000 rpm离心5秒，倒去上清液，以100 l TE悬浮并涂
于SD/-Ura培养基中，置于30℃恒温箱中3~5天。
http://www.ndhu.edu.tw/~life-science/exp/choice.htm
实验4 质体DNA之基本操作技术
I.目的
本实验介绍培养液（broth）或培养基（plate）的制备、大肠杆菌的培养、菌种保存与生长曲线所使用的基本技术。
II.培养液（基）的制备
1.培养细菌或酵母菌（yeast）其培养基必须提供下列几种基本的营养条件：（1）碳源作为能源（2）水分（3）氮源（4）磷（5）硫（6）不同的矿物质养分，如铁和镁。大肠杆菌和酵母菌能在只有一种碳源（如葡萄糖）与简单的氮源（如氯化铵、硫化铵及磷、硫等矿物质）的简单培养基中生长，酵母菌则还需要几种维生素。实验研究上常用到一些复杂的培养基，其主要成分则由复杂的养分（包括植物或动物）所提供的一些不详萃取物。例如LB和YPD培养液，其主要成分是酵母菌萃取物（yeast extract）和蛋白月柬（peptone,一种水解的蛋白质）所组成，这些材料和胺基酸以及不明的辅助因子混合在一起，如维生素等形式提供不同的碳源和氮化合物。液体培养基就是将各成分溶于水中即可，若加入洋菜（agar，从红藻中萃取出来的复杂萃取物，与洋菜胶agarose不同，请勿用错）则成固体培养基。洋菜是固体微生物培养基理想的凝固剂，因它具有良好的溶解特性，但对大部分细菌及酵母菌而言则不具营养价值。固体洋菜在90~100 C会溶解，液体洋菜在约42 C时凝固。灭菌步骤可去除所有活的微生物，培养基在做纯系培养时必须将所有的微生物去除，培养容器则要密封或用棉花、锡箔盖住以避免灭菌后又遭污染。纯系培养过程中所用的液体及容器可用不同的方法消毒，包括高温、放射线照射、过滤等将微生物杀死。制备培养基常需要高压灭菌锅（autoclave），让培养基在特定时间内暴露于高温高压中，通常是121 C的高温，蒸汽压15 Psi，灭菌20分钟。
2.仪器用具：
a. 高压灭菌锅（autoclave）
b. 磁性搅拌器
c. 天秤
d. pH meter
e. 水浴槽
f. 无菌操作台
3.药品及试剂：
a. Tryptone（代替peptone）
b. yeast extract
c. NaCl
d. Agar
e. ampicillin
4.方法步骤：
全班区分数组各制备不同的培养液或培养基。
（A）LB培养液：
1）在500ml锥形瓶中加入1 g tryptone + 0.5 g yeast extract + 1 g NaCl，加水至100 ml刻度并用磁性搅拌器混匀，瓶口以铝箔纸盖住。若用玻瓶装，则旋松盖口（待灭菌后降温再旋紧）。
2）高温灭菌锅消毒。
注：高压灭菌后必须等它慢慢排气，只有当气体完全排除后，才能安全地打开灭菌锅，戴耐热手套取出材料，消毒20分钟实际需要约40分钟，因为还要把空间加热及排气时间包括在内。
（B）LB固体培养基：
１）在500 ml锥形瓶中加入1 g tryptone + 0.5 g yeast extract + 1 g NaCl + 1.5 g agar，加水至100 ml刻度并用磁性搅拌器混合，agar此时无法溶解成悬浮状，瓶口以铝箔纸盖住。
２）高温灭菌锅消毒。
３）灭菌后，小心将瓶放在50 C水浴中，使其降温30分钟。
４）在培养基凝固前，倒入微生物用的培养皿（petri dish），置于抽风柜中，以防污染，待完全凝固后，盖紧盖子标明"LB plate"及日期，放在室温或4 C中备用。
（C）Ampicillin plate：
1）如同前项（B）步骤1）至3）。
2）在培养基凝固前，迅速加入ampicillin使成最终浓度为100 g/ml，摇晃均匀，倒入微生物用的培养皿（petri dish），置于抽风柜中，以防污染，待完全凝固后，盖紧盖子标明"Amp plate"及日期，放在室温或4C中备用。
（D）YPD培养液：
1） 在250 ml锥形瓶中加入1 g tryptone + 0.5 g yeast extract，加水至50 ml刻度并用磁性搅拌器混匀，瓶口以铝箔纸盖住。
2）高压灭菌消毒。
3）冷却至55 C，加入葡萄糖溶液成最终浓度为2%。
（E）YPD培养基：
１）在250 ml锥形瓶中加入1 g tryptone + 0.5 g yeast extract + 1 g agar，加水至50 ml刻度并用磁性搅拌器混匀，瓶口以铝箔纸盖住。
２）高压灭菌消毒。
３）冷却至55 C，加入葡萄糖溶液成最终浓度为2%。
4）倒入微生物用的培养皿（petri dish），置于抽风柜中，以防污染，待完全凝固后，盖紧盖子标明"YPD plate"及日期，放在室温或4 C中备用。
III.大肠杆菌的培养
（A）单一菌落（single colony）之分离：
1.利用微生物的生物技术作纯系（pure line）的保存，常依据纯系培养，常见的有稀释技术或画线法，本实验将介绍后者，乃在培养基表面把混合培养的菌涂开或画成线，让个别的细胞分开。每个分离的细胞会长成一个菌落（colony），可获得一个纯系培养。
2.仪器用具：
a. 37 C恒温箱
b. 酒精灯
c. 接种环
3.药品及试剂：
a. E.coli菌株:DH5
b. LB及LB plate
4.方法步骤：
１）上课前一天，自-70 C取出储存的菌种，培养在LB培养液中并置于37 C恒温箱中振荡培养过夜。
２）每组取1个LB plate，在培养皿底部标明组别、日期及"DH5"。
３）将接种环在酒精灯焰上烧红，环上方部分亦以火焰烧过，将接种环在空白LB plate处轻戳数次以使冷却。
４）取过夜菌液，将接种环浸一下。（若为培养基，则轻刮一个菌落）。
５）打开空白LB plate，将沾有菌落的接种环在其上轻轻连画数条横线，画法各异请参阅图，唯再次画前需将接种环重复火焰灭菌的步骤。
（B）菌落的移殖接种（inoculation）技术
1.生物技术学者均需利用无菌技术，小心操作，才能避免在移殖接种中被不想要的微生物污染。
2.仪器用具：
同上
3.药品及试剂：
同上
4.方法步骤：
基本上同前，唯一差别是接种于LB broth中。
IV.菌种保存
1.菌种保存于15% glycerol（甘油）中，可保存在低温（-70 C）中数月甚至数年。
2.仪器用具：
a. 37 C恒温箱
b. –70 C冰柜
3.药品及试剂：
a. 50% glycerol (autoclaved)
b. 2 ml vial螺旋式保存管
4.方法步骤：
１）于无菌操作台中，将长至mid-log phase之菌液取出700 l置于2 ml螺旋式保存管中。
２）加入300 l 50 % glycerol混合均匀。
３）标示菌种名称及日期，置于-70C冰柜中保存。
V.生长曲线
1.分子生物学中无论是进行胜任细胞的制备，或获得可重复生产之质体DNA及生产重组蛋白质，都必须先了解生物之生长特性。若要获得生长均一的菌类，就必须取对数生长期或指数期的菌类，此时族群中每个细胞之生长速度和成分接近相同。不同培养基依其营养条件及通风情形（氧气）的良好与否，其生长曲线多少会有变化。基本上生长过程包括了呆滞期(lag phase)、对数期(exponential or log phase)、停滞期(stationary phase)和死亡期(death phase)。
2.仪器用具：
a. 37 C恒温箱
b. spectrophotometer
c. 酒精灯
d. 接种环
3.材料：
E.coli菌株: DH5
4.方法与步骤：
１）测量生长曲线前一天，自-70 C取出储存的菌种，培养在LB培养液中并置于37 C恒温箱中振荡培养过夜。
２）各组准备10 ml LB培养液，加入50 l过夜菌液，置于37 C振荡培养。
３）接种1小时后，每隔30分钟取少量菌液测其OD600值，background为LB培养液。
４）以横轴为时间，纵轴为细菌数目取对数（log）做图，画出DH5的生长曲线。
注：1个OD600值约含8108个细菌
啤酒酵母菌01
啤酒酵母菌02
酵母菌污染后生长液似乳白色浑浊，就像北方做馒头用的酵母粉溶于温水中的那种颜色，差不多吧
用灭菌水溶解硫酸铜,温箱里面如37度,就加硫酸铜到饱和,100毫升要25克(30度的溶解度).
1. 彻底通风，停止使用1周；
2. 甲醛（）熏蒸24小时：密闭实验室，将甲醛倒入固体高锰酸甲中，（小心，会喷出来，容器大些，下垫报纸宽些，倒完立刻跑掉，注意安全）。之后通风24小时，味散后进入实验室开始实验。
预防为主.我们的是加如硫酸铜在煮过的蒸馏水里.即培养箱里的水盘本身加有防止霉菌的东西.
不知你们后来的处理如何?能否写出来供我们参考使用.
8个小时，时间短点，用普通肉眼观察差点意思。影响因素有接种量、培养条件、菌中保存与复苏等。用（D）右旋葡萄糖没问题。也许得多培养几个小时，我遇到过这种问题，是细胞冻存不好造成的。
葡萄糖是（D）右旋的
酵母双杂交实验疑难解析
问：如果诱饵蛋白对酵母细胞是有毒的，该怎么办？
答：在有些情况下，在液体培养基中培养不好的菌珠可以在固体培养基上生长得很好。重悬克隆于1ml的SD/–Trp，接着将重悬液平铺于5 个100-mm的SD/–Trp平板。在30℃下温浴，直至平板上的克隆互相粘在一起。用5ml 0.5X YPDA刮下每块板上的克隆，并收集到一管中。接着就使用这个细胞重悬液进行正常的杂交反应。
问：我的诱饵蛋白能直接激活报告基因的表达，该如何处理？
答：该蛋白很可能有转录激活域，是个转录因子。这可以通过基因重组切掉转录激活域，然后重新检测其是否自激活。但重组也有可能破坏蛋白之间的互作。
问：转化效率太低，怎么办？
答：1. 检测一下DNA的纯度，如果可以的话，重新用乙醇纯化。
2. DNA-BD/诱饵蛋白很可能是有毒的。
3. 不适当的培养基，重新配制培养基，并做对照转化。
4. 检测pGBT9对照载体的转化效率，放置于SD/–Trp平板上，转化效率应该在1 x 105 colonies/mg DNA以上。
问：杂交效率不高，该如何处理？
答：在杂交中，预转化的诱饵细胞的数量可能不够。当你对诱饵菌株进行液体培养过夜时，应挑选大的，新鲜的克隆进行培养。经过离心和重悬后，使用血球计对细胞进行计数。密度应该在1 x 109/ml。
一个甚至两个融合蛋白对酵母细胞有毒。你可以通过重组方法来减轻毒性，同时又能保证蛋白的相互作用。或者使用表达水平较低的载体。也可以在琼脂平板或滤膜上进行杂交。但同时必须作杂交对照实验。
细胞的酵母污染图片
Did you use the cloney of the yeast cell or the overnight culture yeast cells to culture? Using the overnight culture cells can grow faster.
Good luck!
1 检查一下YPDA 的pH，
2 确定你的细胞的活力是好的
3培养或盛YPDA 的容器中有没有抑制酵母生长的物质或是未洗干净
基本说明
通过将组织细胞裂解后，以RNase A和Proteinase K消化降解RNA和蛋白质。然后经过简单抽提、沉淀获得基因组DNA。本试剂盒适用于从人或动物的血液、培养细胞、各种组织、Gram+/Gram-细菌中快速抽提基因组DNA。
主要特点
1． 整个抽提过程30分钟，氯仿抽提仅一次，无需酚抽提。
2． 本试剂盒抽提DNA能用于几乎所有分子生物学实验。
3． 按样品准备方法得到的200µl样品中可获得2~10µg DNA。
从上面的介绍看适合于提取酵母基因组DNA
酵母DNA在高盐浓度条件下，DNA吸附于玻璃珠上，吸附了DNA的玻璃珠经离心、洗涤去掉盐和杂物后，进行洗脱重悬于水或TE缓冲液中。DNA回收率高而无降解，操作简单、快速、方便。玻璃珠SIGMA有，可以问问代理。
也可以使用蜗牛酶裂解法破酵母细胞壁法。告诉你一种简便实用的提取酵母质粒的方法，其纯度完全可以用来测序和做PCR。你可以尝试一下。
氯化苄提取真菌基因组的方法。在1.5ml Appendorf管中加入0.1g菌体和500ul提取液，振荡使之充分混合，再加入10％SDS100ul，氯化苄300ul，剧烈振荡，使管内混合物成乳状。50度保温1h，每隔10min振荡混合一次，然后加入300ul 3mol/LNaCl（ph＝5.2），混匀，冰水浴15min，6000rpm，15min，收集上清，加入等体积无水乙醇，室温沉淀20min，这时会有絮状沉淀出现。10000rpm，15min，沉淀用70％乙醇洗一次，室温尽量挥发残留的痕量乙醇，但不要让DNA完全干燥，加入50ulTEbuffer溶解DNA。
提取液：0.1mol/LTris-HCL,PH=9.0+0.04mol/LEDTA,PH=8.0
整个过程也就氯化苄可能需要购买，不过它的价格也非常便宜，500ml只需要32元。^_^
酵母RNA试剂盒的如华舜的，效果还是不错；
下面是我收集的有关酵母基因提取的方法，你也可以参照《分子克隆》上的方法：
1. Transfer 1.5 ml of liquid culture of yeast grown for 20 – 24 h at 30°C in YPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose) into a microcentrifuge tube. Pellet cells by centrifugation at 20,000 × g for 5 minutes.
2. Add 200 μl of lysis buffer (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0).
3. Immerse tubes in a dry ice-ethanol bath for 2 minutes, transfer to in a 95°C water bath for 1 minute. Repeat; vortex 30 seconds.
4. Add 200 μl of chloroform; vortex 2 minutes.
5. Centrifuge 3 minutes, room temperature, 20,000 × g.
6. Transfer the upper aqueous phase to a microcentrifuge tube containing 400 μl ice-cold 100% ethanol. Mix by inversion or gentle vortexing.
7. Incubate at room temperature, 5 minutes. Alternatively, precipitate at -20°C to increase yield.
8. Centrifuge 5 minutes, room temperature, 20,000 × g. Remove supernatant with a pulled Pasteur pipette by vacuum aspiration.
9. Wash the pellet with 0.5 ml 70% ethanol, spin down as described in step 8 above. Remove supernatant.
10. Air-dry the pellets at room temperature or for 5 minutes at 60°C in a vacuum dryer.
11. Resuspend in 25–50 μl TE [10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0)] or water. Samples obtained directly from plates should be resuspended in a 10 μl volume。
另外，建议你发贴前先用搜索功能，看一下有没有人问同样的问题。
我也是参考了“精编分子生物学”上的方法。效果还不错，PCR也扩出了我的目的基因。只是省去了玻璃珠这一步。 供你参考。
（1） YPD 培养基的配制：15gYPD粉末,来自Clontech公司,溶于300ml水中，6分钟121℃高压灭菌后，加入4.5 ml Adenine 溶液（Adenine，Sigma,200ug溶于10ml 0.5M HCl中 ）。
（2） 取YPD培养液3ml 到15ml 离心管中，挑AH109 酵母单克隆到培养液中，30℃，200RPM，4小时培养。
（3） 用10ml YPD培养液培养次级AH109，过夜。
（4） 3000RPM，10分钟离心。用0.5ml水重悬。移液于新的1.5ml EP 管中，在室温下离心，倒掉上清，快速振荡。
（5） 取少量酵母菌沉淀，加1 ml消化缓冲液（见《精编分子生物学》,包括：100mmol/L,NACL; 10mmol/L, Tris.HCl; 25mmol/L EDTA; 0.5% W/V,SDS ）及蛋白酶K（20 mg/ml）,使终浓度达到0.1 mg/ml，65℃水浴使充分消化。
（6） 取出200ul, 加200ul酚/氯仿（1：1）高速震荡3分钟。加TE 200ul, 高速震荡，高速离心13000RPM，5分钟。
（7） 加1/2体积 7.5mol/L (NH3)Ac 及两倍体积无水乙醇,颠倒混匀,室温下13000RPM,3分钟离心。冰70%乙醇洗涤。
（8） 去上清,干燥沉淀, 30ul 无菌水溶解。测OD，-20℃保存。
很多酵母最适生长温度是28度
经过不断的努力，终于得到酵母表达阳性结果。特把表达的一些心得写下来，希望对正在努力中的XDJM有所帮助，也以此感谢丁香园对我的帮助。
分泌型载体：pPICZaC 宿主菌：X33 培养基：BMGY/BMMY 目的蛋白：20KD
1.表达过程中防止污染是第一关键，酵母太容易污染 了。在用BMGY激活培养时，可进行挑单菌落培养24h,而不用常规的1％接种。摇床可定期用75％酒精喷洒消毒。
2.，如果只是检测用，用试管小量培养。先前用250ml的锥形瓶培养，既浪费材料，又耗费精力。目前表达出来的蛋白就是在试管（十几，二十ml的那种）培养的。
3. 1.5ml的BMGY激活24h后，换液，BMMY也用1.5ml.用多少的BMMY决定了你的蛋白表达出来的浓度。用等体积换液，表达完收获的上清不用浓缩，直接上SDS-PAGE。如果担心浓度不够，可缩小BMMY的体积，那实际上也等于在浓缩上清。先前采用大量培养再取上清进行TCA-丙酮法，丙酮法，氯仿－乙醇法浓缩，效果都不好。
4.把电泳图也一并传上，与大家分享！
军科院的方法：
1、用酵母细胞裂解液重悬酵母菌
2、加酚－氯仿
3、加玻璃珠
4、振荡半小时
5、乙醇沉淀
6、电转大肠杆菌
Detailed:
Plasmid Isolation from Yeast
Reagents and Materials Required
The YEASTMAKER Yeast Plasmid Isolation Kit (#K1611-1) provides the SDS and lyticase solutions, CHROMA SPIN-
1000 DEPC-H2O Columns, and 2-ml centrifuge tubes for use with the columns.
• Appropriate SD liquid or agar medium to keep selection on the plasmids (Appendix C.A;
Appendix E).
• Sterile, 1.5-ml microcentrifuge tubes (or a 96-tube microtiter array, multichannel pipettors, and
centrifuge adaptor for multiwell plates).
• 20% SDS
• Lyticase Solution (5 units/ml in TE buffer; store at 4°C for up to 2 months or at –20°C for up to
6 months. If colloidal material precipitates, mix the solution by inversion before using.)
• Recommended: CHROMA SPIN-1000 DEPC-H2O Columns (#K1334-1) and 2-ml centrifuge
tubes for use with the columns
• If you do not use CHROMA SPIN Columns, you will need materials to perform phenol:chloroform
extraction and ethanol precipitation:
• Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1; See Sambrook et al., 19, for information on
preparing neutralized phenol solutions)
• 10 M ammonium acetate
• 95–100% ethanol
1.Prepare yeast cultures for lysis (Step a, b, or c below).
a. From a solid patch of growth:
i. Spread a thin film of yeast cells (~2-cm2 patch) onto the appropriate SD agar medium.
ii. Incubate plate at 30°C for 3–4 days. (The patch should show abundant yeast growth.)
iii. Scrape up a portion of the patch (~10 mm2) and resuspend the cells in 50 ml of sterile
H2O or TE in a 1.5-ml microcentrifuge tube.
b. From a liquid culture:
i. Inoculate a large (2–4-mm), fresh (2–4-day-old) yeast colony into 0.5 ml of the
appropriate SD liquid medium. Vortex tube vigorously to completely break up the colony
and resuspend the cells.
ii. Incubate at 30°C overnight with shaking at 230–250 rpm.
iii. Spin down the cells by centrifuging at 14,000 rpm for 5 min.
iv. Carefully pour off the supernatant and resuspend pellets in the residual liquid (total
volume ~50 ml).
c. For semi-automated handling of a large number of samples:
i. Place a large (2–4-mm), fresh (2–4-day-old) yeast colony into 0.5 ml of the appropriate
SD liquid medium in separate wells of a 96-tube microtiter array. Vortex each tube
vigorously to resuspend the cells. (Alternatively, use 0.5 ml of an overnight SD liquid
culture instead of a yeast colony.)
ii. Using a centrifuge adapted for multiwell plates, centrifuge the entire array at 1,000 x g
for 5 min to pellet the cells.
iii. Carefully pour (or draw) off supernatants and resuspend pellets in the residual medium
(~50 ml) by vortexing or pipetting up and down.
2. Add 10 ml of lyticase solution to each tube. Thoroughly resuspend the cells by vortexing
or repeatedly pipetting up and down.
3. Incubate tubes at 37°C for 30–60 min with shaking at 200-250 rpm.
[Optional] Check a drop of the cell suspension under a phase contrast microscope (400X) for the progress of
cell lysis by adding a drop of 20% SDS to the side of the coverslip. As they come into contact with the SDS, most
cells should lose their refractile appearance and appear as "ghost-like" spheroplasts. If there are still many intact
cells present, incubate the samples for another 30 min.
4. Add 10 ml of 20% SDS to each tube and vortex vigorously for 1 min to mix.
5. Put the samples through one freeze/thaw cycle (at –20°C) and vortex again to ensure
complete lysis of the cells.
6. If necessary, samples can be stored frozen at –20°C. If samples have been frozen, vortex
them again before using them.
7. Pour the entire contents of the tube from Step 5 above onto a prespun CHROMA SPIN-
1000 Column and purify the plasmid DNA according to the CHROMA SPIN User Manual.
Purified plasmid DNA will elute from the column.
If you do not use CHROMA SPIN Columns, clean up the prep as follows:
a. Bring the volume of the sample up to 200 ml in TE buffer (pH 7.0).
b. Add 200 ml of phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1).
c. Vortex at highest speed for 5 min.
d. Centrifuge at 14,000 rpm for 10 min.
e. Transfer the aqueous (upper) phase to a fresh tube.
f. Add 8 ml of 10 M ammonium acetate and 500 ml of 95–100% Ethanol.
h. Place at –70°C or in a dry-ice/ethanol bath for 1 hr.
i. Centrifuge at 14,000 rpm for 10 min.
j. Discard supernatant and dry the pellet.
k. Resuspend pellet in 20 ml of H2O.
Note: The amount of plasmid DNA recovered is small relative to the contaminating genomic DNA;
therefore, it cannot be measured by A260 or seen on an agarose gel.
很可能是染菌了，一般在YPD培养基中18h，OD600就能达到1.0以上了，与没有接种的培养基相比是浑浊状的；若将摇瓶取出放置一会儿，因酵母细胞较大它会沉下去，在摇瓶底部形成粘粘的一层！
菌体呈现颗粒状，我也遇到过该种情况，多为霉菌，因为霉菌的菌丝团会结成团，链霉菌属的居多吧。如果你想看个究竟，可采用一下方法：
1.直接将上述培养的菌丝体用打孔器在菌落边缘打取0.8 cm的菌丝块，放入平板的，28度培养，待其有一定生长量时进行观察。
2.或直接在你的摇瓶中加入灭好菌的玻璃珠，振荡摇瓶将菌丝体打散，在显微镜下观察。YEPD培养基：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母膏1％ （固体加0.9％琼脂），115ºC、20min灭菌.
PDA培养基：土豆200g，葡萄糖20g，水1000mL，115ºC、20min灭菌.
LexA酵母双杂交系统简介
一、LexA酵母双杂交系统的设计原理
报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。
质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。
质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。
在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。
根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。
如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。
二、商品化酵母双杂交系统的组成
1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库
2. 酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株）
3. 大肠杆菌菌株：E.coli KC8株
4. 对照质粒：
质 粒 用 途
pLexA-53，pB42AD-T 阳性对照
pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕 阳性对照
pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒
5. 引物：
pLexA测序引物及pB42AD测序引物。
三、酵母双杂交实验的基本流程
1. 将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD/-Ura筛选。
2. 同时构建或扩增DNA文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。
3. 构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X，作为钓饵(bait)。
4. 将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株，用SD/-His/-Ura筛选；并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。
转化质粒 选择培养基 克隆生长情况 说 明
(含有Gal/Raf)
pLexA-Pos SD/-His，-Ura 蓝 阳性对照
pLexA SD/-His，-Ura 白 阴性对照
PlexA-X SD/-His，-Ura 白 没有直接激活活性
PlexA-X SD/-His，-Ura 蓝 具有直接激活活性
PlexA-X SD/-His，-Ura 菌落不能生长 酵母细胞毒性
4-1. 如果pLexA-X -半乳糖苷酶的信号作用。能够自动激活报告基因，则设法去除其激活活性部位、或者将LacZ报告基因整合入基因组，减少
4-2. 如果pLexA-X虽然不会自动激活报告基因，但对酵母宿主细胞有毒性，则需要与纯化的文库DNA同时转化酵母。
5. 如果pLexA-X既不会自动激活报告基因，也不具有毒性，则可以与纯化的文库DNA同时、或顺序转化酵母细胞，并检测质粒转化效率。
转 化 质 粒 SD固体培养基 LacZ表型
对照1 pLexA-Pos Gal/Raf/-His/-Ura 蓝
对照2 pLexA-53 Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu 蓝
＋pB42AD-T
实 验 pLexA-X Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu 待测
＋pB42AD-文库
5-1. 用SD/-His/-Trp/-Ura培养基选择阳性共转化子，并扩增，使宿主细胞中的质粒在诱导前达到最大拷贝数。
-半乳糖苷酶无表达。5-2. 上述重组子转至含X-gal的固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu，观察LacZ及Leu报告基因的表达情形，蓝色克隆即为阳性。白色克隆为假阳性，说明Leu虽有表达，但
5-3. 同时用LacZ、Leu两个报告基因的目的，是为了尽可能消除实验的假阳性误差，譬如：AD融合蛋白不与目标蛋白结合，而直接与启动子序列结合域结合等情况。由于2个报告基因的启动子不同，出现上述假阳性的几率就大大减少了。
5-4. 将蓝色阳性克隆进行1次以上的划种，尽可能分离克隆中的多种文库质粒。
6. 阳性克隆的筛选
6-1. 随机选取50个阳性克隆，扩增、抽提酵母质粒，电转化E.coli KC8宿主菌，抽提大肠杆菌中的质粒，酶切鉴定是否具有插入片段及排除相同的文库质粒。
6-2. 如果重复的插入序列较多，可另取50个阳性克隆来分析。最后得到数种片段大小不同的插入序列，再转化新的宿主细胞，检测是否仍为阳性克隆。
7. 用质粒自然分选法(Natural Segregation)筛除只含有AD-文库杂合子的克隆
7-1. 将初步得到的阳性克隆接种SD/-Trp/-Ura液体培养基，培养1-2天，含有HIS3编码序列的BD-靶质粒在含有外源His培养基中，将以10％-20％左右的频率随机丢失。
C孵育2-3天。7-2. 将上述克隆，转铺固体培养基SD/-Trp/-Ura，30
7-3. 再挑取生长的单克隆，转入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培养基中，筛选His表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文库杂合子的重组子。
7-4. 将His表型缺陷的克隆转化固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura，以验证AD-文库能否直接激活报告基因的表达，弃去阳性克隆，保留阴性克隆。
8. 酵母杂合试验(Yeast Mating)确定真阳性克隆
如下表所示，在酵母EGY48及其对应的YM4271宿主细胞中分别转入相应的质粒或文库DNA，通过杂合实验确筛选pLexA-靶DNA与pB42AD-文库确实具有相互作用的真阳性克隆。
质粒1
(in YM4271) 质粒2
(in EGY48) LacZ表型 Leu表型
pLexA pB42AD 白 不能生长
pLexA-靶DNA pB42AD 白 不能生长
pLexA pB42AD-文库 白 不能生长
pLexA-靶DNA pB42AD-文库 蓝 真 阳 性
pLexA-Lam pB42AD-文库 白 不能生长
9. 阳性克隆的进一步筛选和确证
9-1. 扩增初步确定的阳性克隆，抽提酵母DNA。该DNA为混合成份，既含有酵母基因组DNA，也含有3种转化的质粒DNA。
9-2. 将上述DNA电转化E.coli KC8宿主菌。由于在大肠杆菌中，具有不同复制起始序列的质粒不相容；同时利用营养缺陷型筛选。因此，在M9/SD/-Trp培养基上，只有含有AD-文库质粒的转化菌才能生长，将其扩增、并抽提质粒DNA，酶切鉴定。
9-3. 用pLexA-靶DNA与pB42AD-库DNA一一对应、共转化只含有报告基因的酵母菌EGY48中，先到SD/-His/-Trp/-Ura板扩增，并与后面的诱导板形成对照，说明报告基因的表达与诱导AD融合蛋白的表达有关，再确证LacZ、Leu报告基因的表达。
9-4. 扩增与靶DNA相互作用的文库DNA，进行序列分析及进一步的结构、功能研究。
10. 对双杂交系统阳性结果的进一步研究
10-1. 用不同的双杂交系统验证
10-1-1. 将载体 pLexA与pB42AD互换后进行双杂交实验。
10-1-2. 选择不同的双杂交系统，如：以GAL4转录激活子为基础的双杂交系统。
10-1-3. 将文库质粒移码突变后，再与靶质粒作用，报告基因是否仍能被激活。
-半乳糖苷酶水平，比较作用强度变化。10-1-4. 去除或突变特定结合位点，定量检测
10-2. 用试剂盒提供的引物测定插入片段的DNA序列，证明其编码区域。
10-3. 用其它的检测方法，如：亲和色谱法或免疫共沉淀法来证明双杂交系统筛选的蛋白之间的具有相互作用。
10-4. 进一步研究靶蛋白与筛选蛋白之间的功能关系
构建于AD载体的cDNA文库的扩增
1. 自-80℃冰箱取出含有cDNA文库的甘油菌，置于冰浴中缓慢化冻。
2. 用新鲜的LB培养液在1.5ml离心管中将上述甘油菌1:106和1:108稀释。
ll加入903. 取稀释菌液各10 90mm)；37℃倒置培养过夜或30℃培养24-36hr，计数平板上单克隆菌落数。LB培养液在1.5ml离心管中振荡混匀，涂布LB/Amp平板(
4. 确定待扩增的cDNA文库滴度(cfu/ml)=克隆数×108(1:106稀释)或克隆数×1010(1:108稀释)。
5. 按照>150mm)，共100块；37℃倒置培养过夜。2-4×104cfu/平板的浓度，涂布LB/Amp平板(
6. 在超净工作台上，在所有生长菌落的平板上加适量LB培养液，将菌落刮下，转入2000ml LB/Amp培养液中，37℃振荡培养2-4hr。
7. 留取适量培养菌液以50%无菌甘油稀释至25%终浓度，分装，保存于-80℃。
8. 其余培养菌液离心8000xg×10min，4℃收集细菌；用质粒DNA纯化试剂盒大量抽提质粒DNA。
LB液体培养基，121℃，15lb/in2灭菌15min
A. bacto-Tryptone 10.0g
B. bacto-Yeast Extract 5.0g
C. NaCl 10.0g
D. ddH2O → 1000 ml
* LB固体培养平板为含有1.5%琼脂(Agar)LB培养基。
** LB/Amp培养基为含有Amp g/ml的LB培养基。50-100
构建于AD载体的cDNA文库的纯化
1. 质粒DNA提取缓冲液
名 称 缓 冲 液 配 方
g/ml RNaseP1 悬浮缓冲液 50mM Tris-HCl(pH8.0)；10mM EDTA；100 A
P2 裂解缓冲液 200mM NaOH；1% SDS
P3 中和缓冲液 3.0M Kac(pH5.5)
QBT 平衡缓冲液 750mM NaCl；50mM MOPS(pH7.0)；15%异丙醇；0.15% Triton X-100
QC 洗涤缓冲液 1.0 M NaCl；50mM MOPS(pH7.0)；15%异丙醇
QF 洗脱缓冲液 1.25 M NaCl；50mM Tris-HCl(pH8.5)；15%异丙醇
2. 培养菌液离心6000xg×10min，4℃，每500ml培养物(下同)的沉淀重悬于50ml P1缓冲液。
3. 加入50ml P2缓冲液，倒置4-6次混匀，室温孵育5min。
4. 加入4℃预冷的50ml P3缓冲液，快速倒置4-6次混匀，冰浴30min(其间再倒置混匀4-6次)。
5. 将上述混合液再倒置混匀，离心12000xg×30min，4℃，保留上清。
6. 上清再离心12000xg×15min，4℃，留上清。
7. 将上清液上样于经35ml QBT缓冲液平衡的QIAGEN-tip层析柱。
8. 以100ml QC缓冲液洗涤层析柱2次。
9. 以35ml QF缓冲液洗脱吸附于层析柱上的DNA。
10. 以0.7倍体积异丙醇沉淀DNA，离心12500xg×30min，4℃，小心去除上清。
11. 以7ml 70%乙醇洗涤沉淀DNA，离心12500xg×10min，4℃，小心去除上清。
12. 将沉淀的质粒DNA溶于5ml TE(pH8.0)缓冲液，转移至新的无菌离心管中，用2.5倍体积无水乙醇；1/10体积3.0M NaAc(pH5.2)，于-20℃静置过夜。
13. 离心12500xg×20min，4℃，去除上清，沉淀用70%乙醇洗涤，超净台风干。
l)，保存于-20℃。g/管(用于1次转化反应，约4014. 干燥的DNA溶于适量体积TE，定量，分装100-200
构建于DNA-BD载体的目的DNA转化酵母感受态细胞
1. 将酵母菌EGY48(p8op-lacZ)接种于5.0ml SD/-Ura液体培养基中，缓振打散菌落，然后转入95.0ml SD/-Ura液体培养基中，30℃恒温，250rpm振荡培养16-18hr，至OD600>1.0。
SD/-Ura液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A. Difco Nitrogen 0.67g
B. 葡萄糖 2.00g
C. 10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura) 10.0ml
D. 20×His 5.0ml
E. 20×Leu 5.0ml
F. 20×Trp 5.0ml
G. ddH2O → 100.0ml
2. 将上述新鲜培养菌液接种于300ml YPD，至OD600=0.2-0.3(约50ml)，30℃恒温，250rpm振荡培养至OD600=0.4-0.5(约3hr)。
YPD液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A. Polypepton 6.0g
B. bacto-Yeast Extract 3.0g
C. 葡萄糖 6.0g
D. ddH2O → 300 ml
3. 室温离心5000xg×5min，弃上清；加入15-25ml ddH2O重悬洗涤沉淀酵母细胞，离心弃上清，沉淀用1×TE/LiAc重悬后，即为酵母感受态细胞。
4. 准备下列试剂
2×转化反应 10×TE 10×LiAc 50% PEG ddH2O
ll / 120l 15A. 1×TE/LiAc 0.15ml 15
l /l 960l 120B. PEG/LiAc 1.20ml 120
ll / / 900C. 1×TE 1.00ml 100
5. 分装待转化的质粒DNA，振荡混匀。
lg) 3-5A. pLexA-X(0.1
B. 10mg/ml lSperm DNA*(0.1mg) 10
* 新配制时水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。
l用1×TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，振荡混匀。6. 每管加入100
l7. 各加入600 PEG/LiAc，振荡混匀，30℃恒温，250rpm振荡培养30min。
l8. 各加入70 DMSO缓和倒置混匀。42℃热休克15min，迅速插入冰浴。
9. 室温离心13000xg×10sec，尽量弃上清；以0.3ml 1×TE重悬沉淀细胞，涂布SD/-Ura，-His固体培养板，30℃倒置培养3-5天。
SD/-Ura，-His固体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min稍冷却后铺板
A. Difco Nitrogen 1.34g
B. 葡萄糖 4.00g
C. 10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura) 20.0ml
D. 20×Leu 10.0ml
E. 20×Trp 10.0ml
F. Agar 4.00g
G. ddH2O 90-100mm)→ 200.0ml 铺8-10块平板(
附表1. 不同规模转化酵母感受态细胞
Small Scale* Large Scale Library Scale
转 化 反 应 20 1 1
(1) SD液体培养基扩增酵母菌 100ml 100ml 300ml
(2) YPD液体培养基扩增酵母菌 300mla 300mla 1000mla
(3) TE或ddH2O洗涤酵母细胞 15mlc 25-50mlb 500mla
(4) 准备 A. 1×TE/LiAc缓冲液 1.5mld 1.0mld 8.0mlc
B. PEG/LiAc缓冲液 12.0mlc 6.0mlc 100.0mlb
C. 1×TE缓冲液 6.0mlc 10.0mlc 10.0mlc
(5) 分装 A. DNA-BD vector gd×20 / 0.2-1.0mgc 0.1
gd 0.1-0.5mgg×20 10-50B. AD vector 0.1
C. l 2.0mll×20 200Sperm DNA(10mg/ml) 10
1×TE/LiAc重悬感受态细胞 1.5mlc 1.0mlc 8.0mlb
l×20 1.0ml 8.0ml酵母感受态细胞 100
(7) PEG/LiAc缓冲液 0.6ml×20 6.0ml 60.0ml
l 7.0mll×20 700 DMSO 70
(9) 室温离心后弃上清 13000xg×10sec 2000xg×5min 2000xg×5min
(10) 1×TE重悬感受态细胞 0.3ml×20 6.0ml 10.0ml
150mm×50150mm×30 90mm×20 铺固体选择培养基平板
注: * 即为“构建于DNA-BD载体的目的DNA转化酵母感受态细胞”
** 在不同容积的无菌离心管中进行，a: 300或500ml；b: 50ml；c: 15ml；d: 1.5ml
文库cDNA转化含有DNA-BD载体的酵母感受态细胞
1. 以生长于SD/-Ura，-His固体培养板上的含有构建于DNA-BD载体的目的DNA及报告基因(p8op-lacZ)的酵母菌EGY48作为宿主菌，制备酵母感受态细胞。
2. 将酵母宿主菌接种于5.0ml SD/-Ura，-His液体培养基中，缓振打散菌落，然后转入95.0ml SD/-Ura，-His液体培养基中，30℃恒温，250rpm振荡培养16-18hr，至OD600>1.0。
SD/-Ura，-His液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A. Difco Nitrogen 0.67g
B. 葡萄糖 2.00g
C. 10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura) 10.0ml
D. 20×Leu 5.0ml
E. 20×Trp 5.0ml
F. ddH2O → 100.0ml
3. 将上述新鲜培养菌液接种于300ml YPD，至OD600=0.2-0.3(约50ml)，30℃恒温，250rpm振荡培养至OD600=0.4-0.5(约3hr)。
YPD液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A. Polypepton 6.0g
B. bacto-Yeast Extract 3.0g
C. 葡萄糖 6.0g
D. ddH2O → 300 ml
4. 室温离心5000xg×5min，弃上清；加入15-25ml ddH2O重悬洗涤沉淀酵母细胞，离心弃上清，沉淀用1×TE/LiAc重悬后，即为酵母感受态细胞。
5. 准备下列试剂
1×转化反应 10×TE 10×LiAc 50% PEG ddH2O
ll / 800l 100A. 1×TE/LiAc 1.0ml 100
l 4.8ml /l 600B. PEG/LiAc 6.0ml 600
C. 1×TE 10.0ml 1.0ml / / 9.0ml
6. 取1.0ml用1×TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，加入下列成份，振荡混匀。
lg) 40A. pB42AD-Library(50-100
B. 10mg/ml lHerring DNA*(2.0mg) 200
* 新配制时水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。
7. 加入6.0ml PEG/LiAc，振荡混匀，30℃恒温，250rpm振荡培养30min。
l8. 加入700 DMSO缓和倒置混匀。42℃热休克15min，迅速插入冰浴。
9. 室温离心2000xg×5min，尽量弃上清。
10. 以6.0ml 100mm，每稀释度各×2)，30℃倒置培养3-5天，确定转化效率在2×106cfu以上有效。l稀释不同倍数，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固体培养板(1×TE重悬沉淀细胞，取10
150mm×30)，30℃倒置培养3-5天。l涂布SD/-Ura，-His，-Trp固体培养板(11. 按每板200
SD/-Ura，-His，-Trp固体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min稍冷却后铺板
A. Difco Nitrogen 13.40g
B. 葡萄糖 40.00g
C. 10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura) 200.0ml
D. 20×Leu 100.0ml
E. Agar 40.00g
F. ddH2O 150mm)→ 2000.0ml 铺30块平板(
12. 在超净工作台上，在所有生长菌落的平板上各加5ml TE(pH7.0)缓冲液，将菌落刮下。
13. 离心弃上清，加入10-20ml TE缓冲液重悬沉淀菌，加入等体积的无菌65%甘油-MgSO4缓冲液，混匀，分装1.0ml/管，保存于4℃ 1周或-80℃1年以上。
65%甘油-MgSO4缓冲液: 65%甘油；100mM MgSO4；25mM Tris-HCl(pH8.0)
A. 甘油 65.00ml
B. MgSO4•7H2O 2.465g
C. 2.0 M Tris-HCl(pH8.0) 1.25ml
D. ddH2O → 100.00ml
酵母双杂合系统阳性克隆的筛选
1. 经过选择培养基筛选的含有DNA-BD载体、文库DNA及报告基因的酵母感受态细胞，用无菌TE稀释至1:104、1:106和1:108等不同浓度。
90mm)，30℃倒置培养3-5天，计数平板上单克隆菌落数。l，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固体培养板(2. 取上述稀释菌液各100
3. 确定待进一步鉴定的酵母菌滴度(cfu/ml)=克隆数×105(1:104稀释)、克隆数×107(1:106稀释)或克隆数×109(1:108稀释)。
4. 按照以前实验确定的文库转化效率的5-10倍的总量、0.5-2×106cfu/平板的菌量，涂布SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固体诱导培养板，30℃倒置培养3-5天。
5. 挑取显蓝色的菌落，再接种于SD/-Ura，-His，-Trp固体培养基以及SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固体诱导培养基，以进一步确证。
SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固体诱导培养基
A. SD/Gal/Raf 3.79g
B. 10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura) 10.0ml
C. Agar 2.00g
D. ddH2O → 85.0ml
灭菌(115℃，10lb/in2)15min ，冷却至50℃，加入下列成份后铺板
E. 10×BU 10.0ml
F. 20mg/ml X-gal 0.4ml 90-100mm)铺5-6块平板(
10×BU缓冲液，121℃，15lb/in2灭菌15min
A. Na2HPO4•12H2O 9.30g
B. NaH2PO4•2H2O 3.90g
C. ddH2O → 100.0ml
20mg/ml X-Gal
A. X-Gal 40mg
B. DMF 2ml
酵母双杂合系统阳性克隆的鉴定
-酵母质粒DNA的提取
1. 挑取经过酵母选择/诱导培养基初步鉴定的酵母单菌落，接种于5.0-10.0ml SD/-Trp液体培养基，30℃恒温，250rpm振荡培养20hr。
SD/-Trp液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A. Difco Nitrogen 0.67g
B. 葡萄糖 2.00g
C. 10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura) 10.0ml
D. 20×His 5.0ml
E. 20×Leu 5.0ml
F. 20×Ura 5.0ml
G. ddH2O → 100.0ml
2. 室温离心5000xg×1min，弃上清，收菌。
l酵母裂解液，振荡重悬沉淀酵母菌。3. 加入200
酵母裂解液: 2% Triton X-100；1% SDS；100mM NaCl；10mM Tris-HCl(pH8.0)；1mM EDTA
A. 10% Triton X-100 20.0ml
B. 10% SDS 10.0ml
C. NaCl 0.58g
D. Tris 0.12g
E. EDTANa2•2H2O 0.04g
F. 1.0M HCl调pH8.0
G. ddH2O → 100.0ml
4. 加入下列试剂，充分振荡5min；液氮冻存10min，室温复融；再充分振荡5min。
A. 经酸处理的玻璃珠(Sigma) 0.20g
B. 苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) 0.2ml
5. 室温离心12000xg×10 min，将上清转移至新的1.5ml 离心管中，加入下列试剂，于-70℃冻存30-60 min。
A. 3 M NaAc(1/10 lV) 20
lB. 无水乙醇(2.5V) 500
6. 离心12500xg×10 min，4℃，弃上清；70%乙醇洗涤沉淀，于 37℃烘箱或超净台干燥DNA；将干燥的沉淀DNA重溶于 l无菌ddH2O中，保存于-20℃。20-30
酵母双杂合系统阳性克隆的鉴定
-酵母质粒DNA电转化大肠杆菌
1. 在冰浴条件下，取待转化DNA l感受态细胞中，混匀。g)，加入100l(5pg-0.51.0
F，2002. 将上述混合液加入间距0.1cm的样品杯中，电转化(1.8kV，25。
3. 迅速加入1ml新鲜的LB培养液，混匀，转入1.5ml 离心管中，37℃恒温，150rpm振荡孵育30-60min。
4. 将上述转化反应液涂布M9/DO(-Trp)固体培养板，37℃倒置培养至单菌落出现(16-22hr)。
5. 按常规方法扩增上述阳性转化菌，碱裂解法少量抽提质粒DNA，酶切筛选AD载体上含有插入片段的阳性克隆，保存其于25%甘油，待进一步验证。
M9/DO-Trp固体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A. 葡萄糖 1.2g
B. Agar 6.0g
C. 5×M9缓冲液 60 ml
D. 10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura) 30 ml
E. 20×His 15 ml
F. 20×Leu 15 ml
G. 20×Ura 15 ml
H. ddH2O 165 ml
冷却至50℃左右，加入下列成份，混匀铺板
I. 1.0M Thiamine-HCl(Vit.B1) 0.3 ml
J. 100mg/ml Amp 0.3 ml 90-100mm)铺10-15块平板(
大肠杆菌感受态细胞的制备(电转化)
1. 挑取LB固体培养基上生长的E.coli KC8单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37℃恒温，250rpm振荡培养过夜(约12-14hr)。
2. 将2.5 ml新鲜菌液接种于500ml SOB培养液中，37℃恒温，250rpm振荡培养至OD600=0.5-0.6(约2.5-3hr)。
SOB液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A. bacto-Tryptone 10.00g
B. bacto-Yeast Extract 2.50g
C. NaCl 0.25g
D. KCl 0.09g
E. MgCl2•6H2O 1.02g
F. ddH2O → 500.0ml
3. 将培养菌液收集于离心管中，冰水浴15-20min。
4. 离心6000xg×10min，4℃，弃尽上清；以5ml 预冷的无菌ddH2O重悬沉淀菌；再加入500ml预冷的无菌ddH2O洗涤细菌。
5. 重复上述步骤1次，以充分去除培养基中残余的盐离子成份。
6. 用40-50ml 预冷的无菌10% 甘油重悬沉淀细菌，转移至50ml 无菌离心管中；离心6000xg×10min，4℃，弃尽上清；重复此步骤1次。
7. 以等体积(约1.5-2.0ml) 预冷的无菌10% 甘油重悬上述沉淀的感受态细胞，分装0.5ml/管(5-6次转化反应)，保存于-80℃备用。
酵母双杂合系统阳性克隆的确证
1. 以含有报告基因(p8op-lacZ)的酵母菌EGY48作为转化宿主菌。
2. 将酵母宿主菌接种于5.0ml SD/-Ura液体培养基中，缓振打散菌落，然后转入95.0ml SD/-Ura液体培养基中，30℃恒温，250rpm振荡培养16-18hr，至OD600>1.0。
SD/-Ura液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A. Difco Nitrogen 0.67g
B. 葡萄糖 2.00g
C. 10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura) 10.0ml
D. 20×His 5.0ml
E. 20×Leu 5.0ml
F. 20×Trp 5.0ml
G. ddH2O → 100.0ml
3. 将上述新鲜培养菌液接种于300ml YPD，至OD600=0.2-0.3(约50ml)，30℃恒温，250rpm振荡培养至OD600=0.4-0.5(约3hr)。
YPD液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min
A. Polypepton 6.0g
B. bacto-Yeast Extract 3.0g
C. 葡萄糖 6.0g
D. ddH2O → 300 ml
4. 室温离心5000xg×5min，弃上清；加入15-25ml ddH2O重悬洗涤沉淀酵母细胞，离心弃上清，沉淀用1×TE/LiAc重悬后，即为酵母感受态细胞。
5. 准备下列试剂
20×转化反应 10×TE 10×LiAc 50% PEG ddH2O
l / 1.2mll 150A. 1×TE/LiAc 1.5ml 150
B. PEG/LiAc 12.0ml 1.2ml 1.2ml 9.6ml /
C. 1×TE 10.0ml 1.0ml / / 9.0ml
6. 分装待转化的质粒DNA。
A. pLexA lg) 3-5or pLexA-X(0.1
lg) 3-5B. pB42AD-Y(0.1
C. 10mg/ml Sperm lDNA*(0.1mg) 10
* 新配制时水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。
l用1×TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，振荡混匀。7. 每管加入100
l8. 各加入600 PEG/LiAc，振荡混匀，30℃恒温，250rpm振荡培养30min。
l9. 各加入70 DMSO缓和倒置混匀。42℃热休克15min，迅速插入冰浴。
10. 室温离心13000xg×10sec，尽量弃上清；以0.3ml 1×TE重悬沉淀细胞，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固体培养板，30℃倒置培养3-5天。
SD/-Ura，-His，-Trp固体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min稍冷却后铺板
A. Difco Nitrogen 3.35g
B. 葡萄糖 10.00g
C. 10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura) 50.0ml
D. 20×Leu 25.0ml
E. Agar 10.00g
F. ddH2O → 500.0ml 90-100mm)铺20-25块平板(
11. 挑取上述固体培养基上生长的含有目的DNA(X)的pLexA-X(+)或空载pLexA(-)单菌落，分别接种SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固体诱导培养板，30℃倒置培养3-5天。
SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固体诱导培养基
A. SD/Gal/Raf 3.79g
B. 10×DO(-His，-Leu，-Trp，-Ura) 10.0ml
C. Agar 2.00g
D. ddH2O → 85.0ml
灭菌(115℃，10lb/in2)15min ，冷却至50℃，加入下列成份后铺板
E. 10×BU 10.0ml
F. 20mg/ml X-gal 0.4ml 90-100mm)铺5-6块平板(
12. 选择含有pLexA-X显蓝色，而相应的不含有插入DNA的空载pLexA显白色的克隆，扩增其在E.coli KC8中的甘油菌，按常规抽提质粒DNA，进行序列分析。
10×DO(-His，-Trp，-Leu，-Ura)
为不含His，Trp，Leu，Ura等成份的10×Dropout溶液。
每1000ml溶液中含有下列成份，用ddH2O配制后保存于4℃。
(1) L-Isoleucine L-异亮氨酸 300mg
(2) L-Valine L-缬氨酸 1500mg
(3) Adenine 腺嘌呤 200mg
(4) L-Arginine HCl L-精氨酸 200mg
(5) L-Lysine HCl L-赖氨酸盐酸盐 300mg
L-Methionine L-甲硫氨酸 200mg
(7) L-Phenylalanine L-苯丙氨酸 500mg
L-Threonine L-苏氨酸 2000mg
(9) L-Tyrosine L-酪氨酸 300mg
20×氨基酸储存液
每100ml溶液中分别含有下列成份，配制后保存于4℃。
20×His L-Histidine L-组氨酸 40mg
20×Trp L-Tryptophan L-色氨酸 40mg
20×Leu L-Leucine L-白氨酸 200mg
20×Ura Uracil 尿嘧啶 40mg
酵母转化缓冲液:
缓冲液 体 积 缓冲液配制
10×TE 100ml Tris 1.21g；EDTANa2•2H2O 0.37g；ddH2O 80ml；盐酸调pH7.5；ddH2O定容
10×LiAc 100ml LiAc•2H2O 10.20g；ddH2O 50ml，冰醋酸调pH7.5；ddH2O定容
50% PEG 100ml PEG3350 50.0g；ddH2O定容
其它缓冲液:
缓冲液 体 积 缓冲液配制
TE 1000ml Tris 1.21g；EDTANa2•2H2O 0.37g；ddH2O 800ml；盐酸调pH；ddH2O定容
STE 1000ml NaCl 5.84g；Tris 1.21g；EDTANa2•2H2O 0.37g；ddH2O 800ml；盐酸调pH8.0；
ddH2O定容
以下是我的方法，曾提过数百个，好像转化效率还可以,基本上都提出来了。
个人体会是Lyticase的活性要好，而且涡流混匀这一步好像要尽量充分吧，u see，酵母质粒所以不好提，就是因为酵母细胞有很厚的细胞壁，再加上酵母质粒拷贝数目多少的问题，所以破壁一定要充分。其次吗？感受态细胞的状态也会有很大的影响……再有，如果担心酵母细胞的活性问题，也可以活化一下再提，不过好象我的实验中这项不是问题.......哈哈….
1. 挑10mm2的酵母溶于含50μl的TE ( pH7.0) 的1.5ml离心管中。
2. 每管加10μl的裂解液（Lyticase 5 unit/μl, sigma避光保存），涡流混匀。
3. 37℃，200-250r/m，30-60min。
4. 每管加10 μl 20％SDS，涡流1min。
5. –20℃冻存过夜。
6. 室温下融解后，涡流混匀。
7. 质粒提取。
7.1 1.5ml离心管加TE Buf至200μl的（pH7.0）
7.2 200μl酚,涡流5min后，4℃，14000r/m离心10min。
7.3 取上清至干净的1.5ml Eppendorf管中。
7.4 等体积酚氯仿，涡流5min。
7.5 4℃，14000r/m离心10min。
7.6 取上清至一干净的1.5ml Eppendorf管后加等体积氯仿，涡流混匀。
7.7 4℃，14000r/m离心10min。
7.8 取上清至一干净的1.5ml Eppendorf管中。
7.9 8μl 10M NH4Ac和500μl 95％～100％的乙醇。
7.10 –70℃，1h。
7.11 4℃，14000r/m离心10min。
7.12 弃上清，空气中干燥。
7.13 10μl H2O悬浮细胞。
8. 转化（要求：4℃预冷）
8.1 冰上融化感受态细胞（感受态细胞的制备见分子克隆啦）Top10f’。
8.2 加100μl转化细胞到预冷的1.5ml离心管中，头轻轻吹打混匀。
8.3 冰上孵育30min。
8.4 42℃，45S～50S。
8.5 冰上孵育2min后，加1ml LB。
8.6 37℃，1h，250r/m.
8.7 2500r/m，5min，RT。
8.8 弃上清，在剩余的溶液中悬细胞。
8.9 接种LB/Amp板，37℃，倒置培养24h。
8.10 挑克隆，过夜培养，常规碱裂解法提质粒
http://immuneweb.xxmc.edu.cn/animated.htm
http://www.promega.com/tbs/tm049/tm049.pdf
http://www.proteomics.com.cn/index_cn.htm
http://www.hgmp.mrc.ac.uk/GenomeWeb/prot-interaction.html下载本文
