3 x 3´ Xylene

3 x 2´ 100% Ethanol

1 x 2´ 95%, 80%, 70% Ethanol (each)

1 x 5´ 1X PBS

2. Antigen retrieval methods:

•Sodium Citrate Antigen Retrieval:

a. Place slides in a glass slide holder and fill in the rest of the rack with blank

slides (10 total) to ensure even heating.

b. Place rack in 600 ml of 10 mM Sodium Citrate (pH 6.0, 100 mM stock) in a

glass 2L beaker. Mark a line at the top of the liquid on the beaker.

c. Microwave for 20 minutes total, replacing evaporated water every 5 min.

d. Cool slides for 20 minutes in the beaker.

e. Wash 4 x 3´ in ddH2O, 1 x 3´ in 1X PBS.

•Proteinase K Antigen Retrieval:

a. Make a fresh solution of: 25 ul of 20 mg/ml Proteinase K

2.5 ml of 1 M Tris-Cl, pH 8.0

0.5 ml of 0.5 M EDTA, pH 8.0

to 50 mls with ddH2O

b. Incubate slides in solution at 37?C for 5 min (do NOT pre-warm Prot K

solution). A Coplin staining jar works well for this step.

c. Wash 3 x 5´ with 1X PBS.

•Urea Antigen Retrieval:

a. Make a fresh solution of 1 M urea

b. Place slides in a glass slide holder and fill in the rest of the rack with blank

slides (10 total) to ensure even heating.

c. Place rack in 600 ml of 1 M urea in a glass 2L beaker. Mark a line at the

top of the liquid on the beaker.

d. Microwave for 10, 20 or 30 minutes total, replacing evaporated water

every 5 minutes.

e. Cool slides for 30 minutes to 1 hour in the beaker.

f. Wash 4 x 3´ in ddH2O, 1 x 3´ in 1X PBS.

3. Shake and wipe off excess 1X PBS. Circle all sections with a Pap pen. Add 50-75 ul of blocking buffer to each section immediately. Don’t touch sections with tip.

Blocking buffers: •5% BSA/0.5% Tween-20 in 1X PBS

•3% BSA in 1X PBS

•3% BSA/0.1% Tween in 1X PBS

•MOM (for mouse and rat monoclonal antibodies, use Molecular

Probes secondary antibodies with MOM basic kit)

4. Incubate 1 hour to overnight at room temperature in a humidified chamber. Do not let the slides touch each other.

5. Dilute primary antibody in blocking buffer (dilutions will vary depending on your antibody). Add 50-75 ul per section and incubate 1 hour to overnight at room temperature in a humid chamber. KEEP DARK.

6. Drain primary antibody off section. Wash slides 3 x 10´ in 1X PBS. You may have towash slides in 1X PBS + 0.1%-0.5% Tween-20 for some primary antibodies.

7. Dilute secondary antibody 1:750 - 1:1000 in 1X PBS. Add 50-75 ul per section and incubate 1 hour at room temperature in a humid chamber.

8. Drain secondary antibody and wash slides 5 x 10´ in 1X PBS.

9. Mount the sections in 3:1 Vectashield:DAPI (Vector labs). Coverslip and seal with clear nail polish.