Chinese Journal of Tissue Engineering Research January 29, 2012 Vol.16, No.5 ISSN 1673-8225 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
871 1Department of Endocrinology, Affiliated Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China;
2Center of Liver Disease, the 458 Hospital of Chinese PLA, Guangzhou 510600, Guangdong Province, China
Xu Yan-hua★, Studying for master’s degree, Department of Endocrinology, Affiliated Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China xyylvls@163.com Correspondence to: Chen Hong, Chief physician, Department of Endocrinology, Affiliated Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China rubychq@163.com Received: 2011-10-28 Accepted: 2011-12-16
促胰素对大鼠胰岛细胞增殖及功能的影响★
徐艳花1，王洪敏2，张振1，蔡德鸿1，于静雯1，吴礼凤1，陈道明2，陈宏1
Effect of pancreatotrophin on the proliferation and function of islet cells in rats
Xu Yan-hua1, Wang Hong-min2, Zhang Zhen1, Cai De-hong1, Yu Jing-wen1, Wu Li-feng1, Chen Dao-ming1, Chen Hong1 Abstract
BACKGROUND: Studies have reported to promote proliferation, differentiation and regeneration of β-cells is a potential
treatment for patients with type 2 diabetes.
OBJECTIVE: To investigate the effects of pancreatotrophin on the proliferation and function of rat islet cells in vitro.
METHODS: The rat islet cells were isolated and purified by collagenase digestion and tissue-culture, followed with the detection
of purity and activity. The islet cells were divided into blank control group and experimental group. Normal culture medium was added in the blank control group, pacreatotrophin in different concentrations were put in the experimental groups (100, 200, 300,
400 mg/L respectively). CCK-8 detection was performed to test the proliferous activity after 1, 3 and 5 days. After 5 days of
culture, insulin release test was carried out in the condition of low-glucose and high-glucose.
RESULTS AND CONCLUSION: Along with the increase of the pancreatotrophin concentration, the proliferate activity of islet
cells was in a dose-dependent manner (P < 0.05), but it demonstrated that there was no obvious time-dependent; In addition to
100 mg/L group and 200 mg/L group, the volume of insulin secretion in 300 mg/L group and 400 mg/L group were significantly
higher than that in the blank control group (P < 0.05). It demonstrates that the concentrations of pancreatotrophin in 300 mg/L and
400 mg/L can not only promote cell proliferation, but also can significantly enhance the function of islet cells to secrete insulin.
Xu YH, Wang HM, Zhang Z, Cai DH, Yu JW, Wu LF, Chen DM, Chen H.Effect of pancreatotrophin on the proliferation and
function of islet cells in rats. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2012;16(5): 871-874.
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摘要
背景：有研究报道，促进胰岛β细胞增殖分化和再生是2型糖尿病患者一种潜在的治疗方案。
目的：观察促胰素对体外培养大鼠胰岛细胞增殖及功能的影响。
方法：采用胶原酶消化和组织培养法分离纯化大鼠胰岛细胞，检测其纯度和活性，将胰岛细胞分为空白对照组和实验组，
空白对照组加入普通培养基，实验组培养基中加入不同质量浓度(100，200，300，400 mg/L)促胰素，培养1，3，5 d后CCK-8法检测细胞增殖活性；培养5 d后行低糖和高糖刺激胰岛素释放实验。
结果与结论：随着促胰素质量浓度的增高，胰岛细胞增殖活性呈剂量依赖性增加(P < 0.05)，但无明显时间依赖性。除100，200 mg/L组外，300，400 mg/L两组胰岛素分泌量均显著高于空白对照组(P < 0.05)。表明300，400 mg/L促胰素不仅可
促进胰岛细胞增殖，而且可显著增强胰岛细胞分泌胰岛素的功能。
关键词：促胰素；胰岛细胞；增殖；胰岛功能；胰岛分离；纯化
doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.05.027
徐艳花，王洪敏，张振，蔡德鸿，于静雯，吴礼凤，陈道明，陈宏.促胰素对大鼠胰岛细胞增殖及功能的影响[J].中国组织
工程研究，2012，16(5):871-874. [http://www.crter.org http://cn.zglckf.com]
0 引言
糖尿病是由多种原因引起的胰岛β细胞功能减退或衰竭，导致胰岛素绝对或相对不足，机体出现糖代谢紊乱，进而造成全身多器官损害的一种内分泌代谢性疾病。近年来，在世界范围内糖尿病的发病率均有着明显的增加，在第20届世界糖尿病大会上，研究者指出，到2025年，全世界的糖尿病患者将达到3.8亿，在中国，根据杨文英[1]教授在新英格兰杂志上发表的研究数据，20岁以上成年人的糖尿病发病率已经达到了9.7%。糖尿病俨然已成为严重威胁人类健康的疾病之一。那么在糖尿病的治疗措施中，人们一方面不断开发新药，希望通过药物治疗能控制血糖、延缓糖尿病进展，而另一方面，对于1型和部分2型糖尿病患者，进行胰岛细胞移植，以获取正常的胰岛，替代已失去功能的细胞。但胰岛细胞来源匮乏和移植后免疫排斥反应一直着胰岛细胞移植的开展。因此探讨胰岛β细胞体内外扩增的条件以期通过增殖来获得足量功能的胰岛细胞和降低其免疫原性，使临床胰岛移植将可能达到理想的效果具有重大的现实意义[2-3]。此外，有研究报道，促进胰岛β细胞增殖分化和再生亦是2型糖尿病患者一种潜在的治疗方案[4-6]。本实验所用的促胰素是从幼龄小猪新鲜胰脏中提取的小分子活性物质溶液，提取液为澄清液体，pH值为6.0~7.0，每1 mL提取液中含多肽不少于15 mg，且不含胰岛素。此动物胰腺提取物是
徐艳花，等. 促胰素对大鼠胰岛细胞增殖及功能的影响
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南方医科大学附属珠江医院内分泌科，广东省广州市 510282；2第四五八医院全军肝病中心，广东省广州市 510600
徐艳花★，女，1985年生，江西省九江市人，汉族，南方医科大学在读硕士，主要从事胰岛再生与移植研究。 xyylvls@ 163.com
通讯作者：陈宏，主任医师，南方医科大学珠江医院内分泌科，广东省广州市 510282 rubychq@ 163.com
中图分类号:R318 文献标识码:B
文章编号:1673-8225 (2012)05-00871-04
收稿日期：2011-10-28
修回日期：2011-12-16 (20111028011/GW ·C)
以糖尿病发生的源头器官胰腺为靶点，选择动物胰腺为原料，通过现代工艺加工而成，以期能促进胰岛细胞增殖分化。
1 材料和方法
设计：对照观察细胞学实验。
时间及地点：于2010-07-20/2011-05-10在广州珠江医院移植免疫研究所完成。
材料：
实验动物：清洁级成年雄性SD 大鼠，体质量
250~300 g ，由南方医科大学实验动物中心提供。
实验试剂及仪器：
实验方法：
大鼠胰岛细胞分离、纯化和培养：参照张桦
等[7]介绍方法的基础上稍加改良，取清洁级成年SD 大鼠，0.8 g/L 胶原酶P 溶液10 mL 胆总管内顺行灌注后(见图1)，完整摘取胰腺，移入预置6 mL Hank’s 液的血清瓶中，39 ℃恒温水浴静止消化至组织呈泥沙状，迅速加入预冷的小牛血清6 mL 终止消化，80目不锈钢筛网过滤后静置3 min ，吸尽上清液，沉淀物加入含体积分数10%胎牛血清的PBS 液，离心(1 200 r/min 、 4 ℃、3 min)，弃上清液，沉淀物加25%Ficoll 溶液8 mL 吹打混匀，其上依次加入23%，20%，11%Ficoll 溶液和PBS 各4 mL ，8 00 r/min ， 4 ℃离心5 min ，吸出23%~25%界面及25%层面的胰岛于另一50 mL 离心管中，加入含体积分数10%胎牛血清的PBS 液30 mL 吹打混匀，离心 (1 200 r/min 、4 ℃、3 min)，弃上清，加入含体积分数20%胎牛血清RPMI-10培养液吹打混匀后，调整细胞至适宜浓度，接种于培养板
后置37 ℃、含体积分数5%CO 2培养箱中进行培养、观察。
胰岛细胞鉴定：双硫腙是一种锌鳌合剂，SD
大鼠的内分泌细胞含有锌，因此双硫腙是胰岛细胞特异性染料。将双硫腙10 mg 溶于3 mL 无水乙醇中，加入50 μL 浓氨水，完全溶解后加入
Hank’s 液10 mL 即为双硫腙储存液[8]
。
取纯化后的细胞悬液0.1 mL 加入Hank’s 溶液0.9 mL ，然后加入双硫腙储存液100 μL 混匀，室温孵育 10 min ，倒置显微镜下观察细胞形态，同时计算纯化后胰岛的纯度。
胰岛细胞功能鉴定：即胰岛素释放实验：在
显微镜下挑50个直径100~150 μm 的胰岛细胞团，分别置低糖(3.3 mmol/L)、高糖 (16.7 mmol/L)无血清RMPI-10培养液中，在37 ℃、体积分数5%CO 2的饱和湿度培养箱中孵育2 h ，放射免疫法测定溶液中胰岛素浓度，计算刺激指数[9]。
细胞活力的测定：取少许纯化的细胞经锥虫
蓝染色后，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染，计算成活率。
实验分组与处理：将分离、培养的胰岛细胞
分为6组：①空白对照组：含体积分数20%胎牛血清RPMI-10培养液培养。②~⑤组培养液中分别加入100，200，300，400 mg/L 促胰素。
胰岛细胞增殖的测定：96孔板中每组细胞分
别设5个复孔，分别培养1，3，5 d 后进行干 预[10]。每孔分别加入10 µL CCK-8试剂，培养箱中孵育1~4 h ，酶联仪检测细胞的D450波长的A 值，反映细胞的增殖活性。
试剂及仪器 来源
猪促胰素 Ficoll-400
胶原酶P 、RPMI 10培
养基、胎牛血清、细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒及双硫腙 胰岛素放射免疫分析药盒
艾塞那肽
倒置相差显微镜 低温离心机 电子移液器
酶标检测仪
CO 2恒温培养箱
第四五八医院全军
肝病中心提供
美国Pharmacia 公司 美国Sigma 公司
北京北方生物技术研究所礼莱公司惠赠
Nickon eclipse TS100，日本
Hettich 公司，德国 Brand 公司，德国 BIO-RAD 公司，美国 Thermo 公司，美国
Figure 1 Pancreas of a SD rat after intraductal collagenase P injection
图1 胶原酶P 胆总管灌注后的SD 大鼠胰腺
纯度=双硫腙染色阳性的胰岛个数/细胞团总数×100%
刺激指数(SI)=高糖时胰岛素浓度/低糖时胰岛素浓度
细胞成活率=未染色细胞数/总细胞数×100%
873 www.CRTER
.org 放射免疫试剂盒检测胰岛素分泌量：各组细胞干预5 d后，
用不含葡萄糖的KRBH液洗涤2次，孵育30 min后弃上清。
分别加入1 mL含3.3 mmol/L葡萄糖的KRBH液37 ℃孵
育2 h，取上清，离心，-20 ℃保存，用于检测基础胰
岛素分泌。再分别加入含16.7 mmol/L葡萄糖的KRBH
液37 ℃孵育2 h，取上清，离心，-20 ℃保存，放射免
疫法检测葡萄糖刺激后的胰岛素分泌量。
主要观察指标：胰岛细胞增殖活性及胰岛素分泌量。
统计学分析：实验数据采用SPSS 13.0软件进行统
计学分析，数据以x_±s表示。采用随机单位组析因方差
分析方法进行主效应和交互效应的分析，组间比较采用
One-way ANOVA，组间两两比较采用LSD法，以
P < 0.05为差异有显著性意义。
2 结果
2.1 分离培养胰岛细胞的镜下观察 SD大鼠胰腺组织
经胶原酶消化后可获得分散较好的胰岛细胞团，在倒置
显微镜下观察，纯化前见大量的外分泌腺细胞散杂有染
成猩红色的胰岛，胰岛细胞胞浆丰富，呈圆形或者卵圆
形，大部分胰岛包膜完整折光性好，见图2；纯化后可
见大片的胰岛细胞团，大量的腺泡组织被去除，见图3。
2.2 胰岛细胞的鉴定双硫腙染色结果：光镜下胰岛
细胞团呈现猩红色，可染率达85%~95%。同时，用锥
虫蓝染色法测定细胞活力为90%以上。
2.3 胰岛素释放实验高糖刺激后胰岛素释放量为低
糖的2.35倍[分别为(12.30±1.18) IU/mL和(5.20±
0.53) IU/mL，P < 0.05]，提示胰岛β细胞功能良好。
2.4 促胰素对大鼠胰岛细胞增殖的影响各组胰岛细
胞增殖活性见表1。
经不同干预因素处理5 d后，低糖刺激后胰岛素的
分泌量5组间差异有显著性意义(F=4.904，P=0.003)，Figure 2 Dithizone staining of early isolated islet cell mass of
rats (×200)
图2 初分离大鼠胰岛细胞团的双硫腙染色(×200)
Figure 3 Dithizone staining of purified islet cell mass of rats
(×200)
图3 纯化后SD大鼠胰岛细胞团的双硫腙染色(×200)
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多重比较结果显示：除100，200 mg/L 促胰素组外，其余两组胰岛素分泌量均显著高于空白对照组(P 均< 0.05)，且300 mg/L 促胰素组与400 mg/L 促胰素组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。高糖刺激后胰岛素的分泌量5组间差异有显著性意义(F =8.574，P =0)，多重比较结果显示：除100 mg/L 促胰素组和200 mg/L 促胰素组外，其余两组胰岛素分泌量均显著高于空白对照组(P 均< 0.05)，且300 mg/L 促胰素组与400 mg/L 促胰素组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。
高糖与低糖之间比值即胰岛素释放指数是反映胰岛细胞功能的一项指标，本实验中胰岛素刺激指数5组间差异有显著性意义(F =5.387，P =0.011)，多重比较结果显示：除100 mg/L 促胰素组和200 mg/L 促胰素组外，其余两组胰岛素分泌量均显著高于空白对照组(P 均< 0.05)，且300 mg/L 促胰素与400 mg/L 促胰素组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。
3 讨论
本实验结果显示，在CCK-8比色法测定中，300 mg/L 促胰素和400 mg/L 促胰素组吸光度值显著高于空白对照组，提示至少在体外培养条件下促胰素可增加胰岛细胞的数量。同时观察到大鼠胰岛细胞经促胰素干预5 d 后，低糖与高糖刺激的胰岛素水平除100
，200 mg/L 促胰素组外，其余两组胰岛素分泌量均显著高于空白对照组。这表明300 mg/L 和400 mg/L 促胰素不仅可促进胰岛细胞增殖，而且可显著增强胰岛细胞分泌胰岛素的功能。促胰素促进β细胞增殖可能通过以下途径：磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)及其下游的细胞外信号调节激酶(ERK)1/2和p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)或蛋白C(PKC)；cAMP/蛋白激酶A(PKA)介导的pdx-1的转录[11]。
现有的研究表明促进胰岛细胞体内增殖分化与再生可能是治疗2型糖尿病的一种潜在的方案，同时胰岛移植治疗糖尿病亦将显示巨大的临床价值和前景，但供体来源、免疫排斥反应以及移植物存活率仍是当前面临的主要问题。随着干细胞研究的深入，分子生物学的发展，新型免疫诱导及抑制剂的研发，胰岛移植必将成为1型糖尿病和部分2型糖尿病治疗的有效手段，然而，众所周知，胰岛在移植前体外培养是个极其复杂的环境，胰岛分离、纯化、培养、低氧和移植环境中非特异性炎症因子等应激都可以使胰岛细胞发生凋亡而影响胰岛移植物的存活[12]。因此，在目前仅有的科研及医疗条件下，寻找具有促进胰岛β细胞增殖、抗凋亡作用的细胞因子，不仅为治疗2型糖尿病提供了更多的选择方案，同时也为1型糖尿病胰岛移植成功提供了必要的前提。本实验显示促胰素有促进胰岛细胞增殖的作用，并能显
著增强胰岛细胞分泌胰岛素的功能。
致谢：衷心感谢导师陈宏教授的指导；感谢第四五八医院全军肝病中心陈道明主任和王洪敏博士技术上的指导及帮助；感谢师兄张振硕士及珠江医院内分泌科全体工作人员，感谢吴礼凤硕士、于静雯硕士、郭南京博士等给予耐心的指导、无私的帮助和关心。
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