一、实验目的

1．掌握荧光法测定维生素B2 的方法。

2．学习荧光分析法的基本原理和实验操作技术。

二、实验原理

多数分子在常温下处在基态最低振动能级，产生荧光的原因是荧光物质的分子吸收了特征频率的光能后，由基态跃迁至较高能级的第一电子激发态或第二电子激发态，处于激发态的分子，通过无辐射去活，将多余的能量转移给其他分子或激发态分子内振动或转动能级后，回至第一激发态的最低振动能级，然后再以发射辐射的形式去活，跃迁回至基态各振动能级，发射出荧光。荧光是物质吸收光的能量后产生的，因此任何荧光物质都具有两种光谱：激发光谱和发射光谱。 

维生素B2，也称核黄素，溶于水，为维生素类药物。参与体内生物氧化作用。其分子结构式如下：

维生素B2 本身为黄色，由于分子结构上具有异咯嗪结构，在430~440nm蓝光或紫外光照射下会产生黄绿色的荧光。荧光峰在535nm, 在pH6~7的溶液中荧光强度最大，在pH11的碱性溶液中荧光消失。其它如维生素C在水溶液中不发荧光，维生素B1本身无荧光，维生素D用二氯乙酸处理后才有荧光，因而它们都不干扰维生素B2的测定。

    维生素B2在一定波长光照射下产生荧光，在稀溶液中，其荧光强度与浓度成正比，因而可采用标准曲线法测定维生素B2的含量。

三、仪器与试剂

930型荧光光度计。

维生素B2标准溶液(10mg／L)：准确称取10rng维生素B2溶于热蒸馏水中, 冷却, 转移至1000mL容量瓶中, 加蒸馏水定容, 摇匀, 置暗处保存。

冰醋酸 (A.R);

维生素B2片。

四、实验步骤

1．维生素B2标准溶液的配制

移取维生素B2标准溶液 (10mg/L) 0.00、1.00、2.00、3.00、4.00及5.00mL分别置于50mL容量瓶中，加入冰醋酸2mL, 加水至刻度，摇匀，待测。

 2．样品溶液的制备

    取维生素B210片，研细。准确称取适量(约相当维生素B210mg)置于100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。过滤，吸取滤液10.0mL于100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。吸取此溶液2.00 mL于50mL容量瓶内，加冰醋酸2mL, 用水稀释至刻度，摇匀，待测。

3．测定

    (1)选择合适的荧光滤光片  先固定一块激发光滤光片(暂用360nm的)置于光源和被测液之间的光径中，将波长稍长于激发光的荧光滤光片放在被测液和检测器之间的光径中，接通仪器电源开关，打开样品室盖，旋动调零电位器，使电指针处于“0”位。仪器预热20min，将某一浓度的维生素B2标准溶液放入样品室，盖上样品室盖，测定其荧光强度。若荧光读数较小，可调节较大灵敏度值。反之，可调节较小灵敏度值。然后更换不同波长的荧光滤光片，依次同上法测定各荧光强度，选择荧光强度最强的一块荧光滤光片供测定用。

    (2)选择合适的激发光滤光片  将已选择好的荧光滤光片固定，用不同波长的激发光滤光片代替360nm的滤光片，依次同上法测定其荧光强度，选择荧光最强的一块激发光滤光片供测定用。

    (3)将浓度最大的维生素B2标准溶液放人样品室，盖上样品室盖，调节刻度旋钮至满刻度(必要时可调节灵敏度钮至满刻度)，然后从低浓度至高浓度依次测定维生素B2系列标准溶液和空白溶液的荧光强度，最后测定样品溶液。在测定数据中扣除空白溶液的荧光强度。

五、数据记录与处理

  1、列表记录各项实验数据。绘制吸收光谱及荧光光谱曲线。

  2、以荧光光强度为纵坐标，标准系列溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。

  3、从标准曲线上查得维生素B2的质量(μg)，然后根据样品质量m，按下式计算样品中维生素B2的百分含量。

             B2%=

六、思考题

1、激发波长与荧光波长有什么关系？   

  2．选择360nm、400nm两块滤光片分别作激发光滤光片时，对测定结果有何差异?下载本文