一、试剂
考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G―250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL。
二、标准和待测蛋白质溶液
1. 标准蛋白质溶液
结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用9gl/L NaCl配制成0.1 mg/mL蛋白溶液。
三、器材
试管1.5×15 cm(×6)，试管架，移液管管0.5 mL(×2);1 mL(×2);5 mL(×1);恒温水浴;分光光度计。
操作方法
一、制作标准曲线
取7支试管，按下表平行操作。
| 试管编号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
| 标准蛋白溶液（mL） | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 | 0.6 | 0.7 | 0.8 | 0.9 | 1.0 | |
| 9gl/LNaCl（mL） | 0.1 | 0.9 | 0.8 | 0.7 | 0.6 | 0.5 | 0.4 | 0.3 | 0.2 | 0.1 | 0 | |
| 考马斯亮蓝试剂 | 4mL | |||||||||||
| 蛋白质浓度ug/ml | 0 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 90 | 100 | |
摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595 nm处比色 | ||||||||||||
二、未知样品蛋白质浓度测定
测定方法同上，取1样品，加4ml考马斯亮蓝溶液，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595 nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(ug/mL)。（超出范围应稀释样品。）
注意事项
在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一定要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定，防止误差。
Oorigin做直线图，直线拟合后出如下图，R2=-0.997
Y=0.00687 X + 0.0527，应用公式计算未知样品蛋白质浓度。下载本文
