课程设计

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1、设计题目： 

单批次液体发酵50吨需氧菌的发酵工艺设计

2、设计任务：

（1）基本工艺流程设计

（2）单批次液体发酵50吨需氧菌的发酵的相关工艺参数计算

（3）种子罐及发酵罐选型与计算

3、基本工艺流程：

保藏枯草芽孢杆菌的菌种→平板划线培养→挑取单菌落→菌种摇瓶培养→种子扩大培养→主发酵→半成品

4、设计依据：

枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞 0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动，革兰氏阳性菌。枯草芽孢杆菌的生理特征为专性好氧，不具凝乳作用，过氧化氢酶实验、盐还原实验、V-P实验阳性。苯丙氨酸脱氨酶实验、卵黄卵磷脂酶实验阴性，解葡萄糖产酸不产气，能分解阿拉伯糖、甘露醇、酪素、明胶、淀粉。菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。刺激动物免疫器官的生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力；能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性。

 枯草芽孢杆菌不仅在饲料中应该比较广泛,在污水处理及生物肥发酵或发酵床制作中应用也相当广泛,是一种多功能的微生物。

二、概述

2.1菌种

菌种名称：枯草芽孢杆菌

拉丁学名 ：Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn

2.1.1生理特性 

枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系，故常作选育核苷生产菌的亲株或制取5'-核苷酸酶的菌种。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名枯草芽孢杆菌。

2.1.2功能特性 

  1、能调节动物肠道菌群平衡 ,改善肠道微生态环境 ,促进动物生长和提高抗病力。

  2、在不利环境条件下能以孢子形式存在 ,在饲料制粒、 贮存及胃酸环境中仍能保持高活性。

  3、能刺激动物免疫器官的生长发育 ,激活淋巴细胞 ,提高免疫球蛋白和抗体水平 ,增强细胞免疫和体液免疫功能 ,提高机体免疫力。

  4、能自身合成消化性酶类 ,如蛋白酶、 淀粉酶、 脂肪酶和纤维素酶等 ,与内源消化酶共同发挥作用 ,促进养分的消化吸收。文章以一株枯草芽孢杆菌为研究对象 ,对其摇瓶发酵培养基及发酵条件进行优化 ,为其规模化发酵提供依据。

2.1.3作用机理 

　1、枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用； 

　2、枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑制其它致病菌生长； 

　3、刺激动物免疫器官的生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力； 

  4、枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用； 

  5、能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性。

2.1.4菌种用途 

　1、该菌种对特殊菌体进行促芽孢和微胶囊包被处理，在孢子状态下稳定性好，能耐氧化；耐挤压；耐高温，能长期耐60°C高温，在120°C温度下能存活20分钟；耐酸碱，在酸性胃环境中能保持活性，可以耐唾液和胆汁的攻击，是饲料微生物中可100%直达大小肠的活菌。

　2、枯草芽孢杆菌以孢子状态进入消化道后，迅速由休眠状态复活，在短期内繁殖成高含菌量的优势种群，消耗掉肠道内大量氧气，并能产生过氧化氢、细菌素，建立微生态平衡，促进有益厌氧微生物的繁殖，抑制有害细菌（大肠杆菌、沙门氏杆菌）的生长，从而预防腹泻、下痢等肠胃道疾病。

　3、在快速繁殖过程中，产生大量多种维生素、有机酸、氨基酸、蛋白酶（特别是碱性蛋白酶）、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，能降解植物性饲料中复杂的有机物，从而促进消化吸收，提高饲料利用率，防止动物消化不良，出现“饲料便”等状况发生。

　4、该菌种安全高效，无药残，无毒副作用，能减少抗生素药物的使用，增强免疫力。同时缓解动物不进食，生长缓慢等不良应激反应状态，恢复由于用药造成的动物体质下降，提高疫苗抗体水平等综合抗病力。

　5、除臭驱蝇，减少污染，控制细菌性疾病，能减少粪便中氮、磷、钙的排泄量，减少粪便臭味及有害气体排放，表现为动物粪便臭味逐步减轻，减少饲料蛋白质分解为氨气浪费，从而减少环境污染。

　6、改善肉蛋奶品质，生产“绿色肉”、“农家蛋”、“无抗奶”，本品通过增强消化吸收功能，充分吸收利用饲料中营养成份及原料的天然色素，无需添加化学色素苏丹红、加丽素红造成对人体的有害物质及影响畜禽产品天然食用风味，可媲美家养畜禽肉。能天然增加动物产品着色度和食用风味，猪只皮肤红润，毛色发亮；肉鸡肉鸭颜色加深；改善蛋壳的质量和颜色，蛋清厚稠，蛋黄鲜红；水产动物颜色更加健康，无斑点。

2.2菌种培养参数的选择 

2.2.1最佳生长时间的选择 

由下图可知,发酵培养0～2 h 为枯草芽孢杆菌的生长停滞期 ,细菌数量极少;自 2 h 以后进入对数生长期 ,菌体数量急剧增多;在 12 h 达到生长高峰期 ,8～12 h为枯草芽孢杆菌生长的稳定期 ,菌体生长缓慢。自12 h后细菌数量开始减少 ,枯草芽孢杆菌进入生长衰亡期。因此 ,采用 8～12 h 时的菌液作为菌种较合适 ,此时枯草芽孢杆菌为对数生长末期 ,既可保持高的细胞活力 ,又可获得尽可能多的细胞数。

1.2.2最佳接种量的选择 

分别选取1 %、 3 %、 5 %、 7 %和 9 %5 个接种量 ,在摇瓶发酵培养条件下培养12 h ,用稀释平板计数法测其活菌数。由下图可知 ,枯草芽孢杆菌生长的最适接种量为3% ,在1 %～9 %范围内时 ,接种量对枯草芽孢杆菌活菌数的影响差异很小。

1.2.3最佳装液系数的选择 

选取20、 40、 60、 80和100 mL 5个装液量分别测定不同装液量对发酵液活菌数的影响 ,在摇瓶发酵培养条件下培养12 h ,用稀释平板计数法测其活菌数。

1.2.4培养参数汇总表 

三、设计依据

3.1总体生产规模

单批次液体发酵50吨枯草芽孢杆菌（需养菌）的发酵

3.2 基本发酵工艺流程

保藏菌种（平板划线培养、 试管斜面培养 ）——菌种摇瓶培养—— 多级种子发酵罐培养 —— 生产发酵 

3.2.1 菌种的活化

将冷冻保藏管中的菌种在斜面中活化（37℃ 24h），并在平板中进行纯化（37℃ 24h）。

3.2.2 种子液制备

取一环纯化后的的菌种，接入装量为20mL种子培养基的250mL三角瓶中，置于180r/min中摇床中培养 (37℃ 18h)。 分别取1mL的种子液 ,接入五个盛有20mL发酵培养基的250 mL 三角瓶中。置于150 r/ min摇床中 培养（30 ℃ 12 h） 。

3.2.2 一级发酵罐发酵

将80mL的种子液接入装有1.35L发酵液的2L发酵罐中，37℃, 180r/min培养12h。

3.2.3 二级发酵罐发酵

将1.35L的种子液接入装有45L发酵液的70L发酵罐中，37℃, 180r/min培养12h。

3.2.4 三级发酵罐发酵

将45L的二级种子液接入装有1500L发酵液的2.5t发酵罐中，180r/min培养12h。

3.2.4 四级发酵罐发酵

将1500L的三级种子液分别接入装有20t发酵液的30t发酵罐和30t发酵液的50t发酵罐中，180r/min培养12h。

3.3 工艺流程简图

3.4发酵工艺设计理论参数与及工艺环节参数的选择原则 

发酵工艺中影响因素主要包括生长时间、温度、PH、接种量、装液量等。

生长时间：理论上：发酵培养，0～2 h 为枯草芽孢杆菌的生长停滞期 ,细菌数量极少;2 h 以后进入对数生长期 ,菌体数量急剧增多; 12 h 达到生长高峰期，8～12 h为枯草芽孢杆菌生长的稳定期 ,菌体生长缓慢。12 h后细菌数量开始减少 ,枯草芽孢杆菌进入生长衰亡期。因此 ,我们在这里采用 8～12 h 时的菌液作为菌种较合适 ,此时枯草芽孢杆菌为对数生长末期 ,既可保持高的细胞活力 ,又可获得尽可能多的细胞数。

温度：理论上枯草芽孢杆菌在25—40℃均可良好生长，其生长的最适温度为35℃。在这里采用理论最适温度。

PH：采用初始PH 6.0

接种量：在1 %～9 %范围内时 ,接种量对枯草芽孢杆菌活菌数的影响差异很小且在摇瓶发酵培养条件下培养12 h时，枯草芽孢杆菌生长的最适接种量为3% 。因此采用接种量为3%，在种子液接种到一级发酵罐中，可采用较大的接种量5%。

理想的装液系数为8%~40%。这里我们采用8%。  

根据上述结果汇总发酵培养参数

发酵工艺设计理论参数 

主发酵罐的选定

我所设计的是单批次50t，故根据50吨的生产产量，以及发酵罐的理论装液系数的范围在60%-70%进行生产发酵罐容积的计算，因为考虑到产品供应的市场的边际收益和成本问题，将50t可以分成20t和30t进行生产。计算如下

20t×1000L/t=20000L         

20000L÷60%=33333L

20000L÷70%=28571L

生产发酵罐20t的选择范围在33333L-28571L

根据发酵罐的规格，所以选择30000L的发酵罐进行生产

20000L÷30000L=66.7%

此时实际装液率为66.7%

30t×1000L/t=30000L

30000L÷60%=50000L

30000L÷70%=42857L

生产发酵罐30t的选择范围在50000L-42857L

根据发酵罐的规格，所以选择45000L的发酵罐进行生产

30000L÷45000L=66.7%

此时实际装液率为66.7%

种子罐的选定 

1四级种子罐

根据枯草芽孢杆菌的接种量的理论范围1-10%，我们选择3%做为实际接种量

50000L×3%=1500L

1500L÷60%=2500L

1500L÷70%=2143L

二级发酵罐的选择范围在2143L-2500L

根据种子罐的规格，所我选择2500L的二级种子罐进行生产

1500L÷2500L=60%

此时实际装液率为60%

2三级种子罐

根据枯草芽孢杆菌的接种量的理论范围1-10%，以及对理想接种量3%的考虑,同时考虑二级种子罐的规格大小

1500L×3%=45L

45L÷60%=75L

45L÷70%=L

以及发酵罐的选择范围是L-75L

根据种子罐的规格，选择70L的一级种子罐进行生产

45L÷70L=.3%

此时实际装液率为.3%

3二级种子罐

根据枯草芽孢杆菌的接种量的理论范围1-10%，以及对理想接种量3%的考虑,同时考虑二级种子罐的规格大小

45L×3%=1.35L

1.35L÷60%=2.25L

1.35L÷70%=1.93L

以及发酵罐的选择范围是1.92L-2.25L

根据种子罐的规格，选择2L的一级种子罐进行生产

1.35L÷2L=67.5%

此时实际装液率为67.5%

4一级种子——摇瓶数量型号的选择

根据枯草芽孢杆菌的接种量的理论范围1-10%，以及对理想接种量3%的考虑,同时考虑三角瓶的装液系数是8%-20%，理想装液系数是8%

我们选择5%做为实际接种量，选择8%为实际装液率

1.35L×5%=0.675L=67.5mL

67.5mL÷8%=843.75mL

这样我们可以选择5个250mL的三角瓶进行培养

根据实际操作情况为了避免染杂菌，我们5+1=6个三角瓶进行培养

5空气压缩机的选择

根据发酵罐每分钟需氧量来确定空气压缩机的型号。

根据转子流量计1:1的比值，按照最大的装液系数70%计算

主发酵罐20t每分钟需空气为30000L×70%=21000L

主发酵罐30t每分钟需空气为50000L×70%=35000L

种子罐每分钟需空气的量为（2500L+70L+2L）×70%=1800L

总共需要空气的量为21000L+35000L+1800L=57800L    57800L÷1000L/t=57.8t

所以所选择的空气压缩机应能够供应57.8t/min的空气量

同时考虑空气压缩机本身的使用情况，不能全动力投入使用，需要留一定的额度，而保证其寿命及生产。

空压机的体积流量为58m3/min，所以我们选择60m3/min的空压机.又因回转式空压机结构简单易损件少，容易维护，操作，并且有安装灵活的特点。其气量要求在0.85 m3/min-85 m3/min。故可以采用60 m3/min的空压机。

6锅炉的选择

锅炉的种类有燃煤锅炉，燃油锅炉，燃气锅炉，根据地方管理的要求，及环境保护的原则和效益最大化我们选择燃气锅炉。

7实际确定的发酵设备选型推算结果参数汇总

1.史仲平，潘丰．发酵过程解析、控制与检测技术．北京：化学工业出版社，2005

2.叶勤，发酵过程原理．北京：化学工业出版社，2005

3.孙彦．生物分离工程．北京：化学工业出版社，1998

4.王福源．现代食品发酵技术．北京：轻工业出版社，1998

5.顾国贤．酿造酒工艺学（第二版）．北京：中国轻工业出版社，1996

6.桂祖发．酒类制造．北京：化学工业出版社，2001